Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

ELISA Asas :间接、三明治和竞争
 

ELISA Asas :间接、三明治和竞争

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

酶相关的免疫吸附测定,或ELISA是一种高度敏感的定量测定,通常用于测量分析物(如细胞因子和抗体)在生物样品中的浓度。这种测定的一般原则包括三个步骤:从捕获或固定在微板上的目标分析剂开始,然后通过目标特异性检测蛋白检测分析剂,最后,酶反应,其中偶联酶将其基质转化为彩色产物。基于不同的捕获和检测方法,ELISA 可以有四种类型:直接、间接、三明治和竞争。

对于直接ELISA,目标抗原首先结合到板,然后由特定的检测抗体检测。这种方法通常用于筛选特定抗原的抗体。间接 ELISA 用于检测样品中的抗体,以量化免疫反应。板首先涂有特定的捕获抗原,使目标抗体固定不动,然后使用第二种抗体检测这种抗原抗体复合物。

在三明治ELISA的情况下,靶向酶是一种抗原,利用捕获抗体在板上捕获,然后被检测抗体检测,从而形成抗体-抗原-抗体三明治。此方法可用于测量混合样品中抗原的浓度。

当目标抗原只有一种抗体可用时,使用竞争 ELISA。板首先涂有纯化抗原。同时,含有抗原的样品与抗体预先孵育,然后加入板中,使任何游置的抗体分子与固定抗原结合。来自板的信号越高,样品中的抗原浓度越低。在所有四种类型的ELISA中,直接、间接、三明治和竞争,检测抗体要么直接与酶结合,要么可以通过另一种抗体或蛋白质与酶间接相关。

通常用于反应的酶是马萝卜过氧化物酶或碱性磷酸酶及其各自的基质,都产生可溶性,有色产品,可以使用板读取器测量和量化。在本视频中,您将观察如何执行间接 ELISA、三明治 ELISA 和竞争 ELISA,然后从间接和三明治 ELISA 方法量化目标解毒剂的示例。

第一个实验将演示如何使用间接ELISA来确定从流感感染小鼠获得的血清中是否存在抗流感病毒抗体。

首先,在96孔ELISA板的每个孔中加入50微升的纯化抗原——在这种情况下,每毫升纯化A/PR/8流感病毒2毫克。接下来,用胶粘剂盖覆盖板,并在4摄氏度下孵育,使抗原与板结合。第二天,通过在水槽上轻拂板来去除涂层溶液。接下来,通过在每个孔中加入200微升的阻塞缓冲液,将5%的驴血清加入1XPBS-来阻断涂布井中剩余的蛋白质结合位点。在室温下,让盘子孵育至少2小时。孵育后,取出阻塞缓冲液,然后通过加入含有1%补间-20的1X PBS的200微升洗板。再次将板轻拂水槽以取出洗涤液。

然后,通过在新鲜管中加入460微升的PBS,然后加入40微升的血清,使1至12.5微液稀释,制备测试样品。然后,将300微升的PBS添加到第二管中,然后加入100微升的第一次稀释。继续此串行稀释范围,直到获得稀释 1 到 204,800 的最终样品。将连续稀释的血清样品加入井中。用胶粘剂盖板盖住盘子,在室温下孵育一小时。接下来,将板轻拂到水槽中,然后通过加入含有 1% 补间-20 的 200 微升 1X PBS 来清洗板。再次,轻拂盘子以取出洗涤液。

现在,在每个孔中加入100微升的酶结合二级抗体,该抗体是马萝卜过氧化物酶,或HRP,结合驴抗小鼠二次。"在室温下孵育板一小时,轻拂板以去除多余的液体。用含有 1% 补间-20% 的 1X PBS 清洗板,然后以每毫升 1 毫克的浓度将 100 微升指标基板涂抹到每个孔。在室温下用基板孵育5至10分钟。在此示例中,无色 3,3'、5,5' - 四甲基苯甲酸(TMB)基板在存在 HRP 时变为蓝色。10分钟后,加入100微升2N硫酸,停止酶反应。样品将变成黄色。

在加入停止溶液的 30 分钟内,将板插入微孔板读取器中,以适当的波长读取板,以确定孔的吸光度。

要开始三明治ELISA,板必须涂上纯化捕获抗体。为此,在96孔ELISA板的每个孔中,以每毫升1-10微克的浓度添加100微升捕获抗体。接下来,用粘合板盖盖板,然后在 4 摄氏度下孵育板过夜。孵育后,通过在水槽上轻拂板来去除涂层溶液。

现在,通过在井中加入200微升5%的脱脂干牛奶,阻断涂布井中剩余的蛋白质结合点位。在室温下孵育板至少2小时。接下来,取出阻塞缓冲液,然后用含有 1% 补间-20 的 1X PBS 清洗水井。将盘子轻拂在水槽上,取出洗涤液。现在,将100微升的测试样品加入井中,用粘合剂盖密封板,然后在室温下孵育2小时。孵育后,将盘子轻拂水槽,然后用含有1%补间-20的200微升1X PBS清洗孔。轻拂水槽上的盘子,取出洗涤液,然后将100微升的酶结合检测抗体添加到井中。

用粘合剂盖密封板。将盘子留在室温下孵育2小时。孵育后,通过轻拂水槽上的板来去除未结合的检测抗体,用含有1%补间-20的200微升1X PBS清洗孔。接下来,以每毫升1毫克的浓度加入100微升的指标基板,并在室温下孵育5至10分钟。10分钟后,在孔中加入100微升2N硫酸,然后在微孔板读片器中加入停止溶液后30分钟内读取板,从而停止酶反应。

为了执行具有竞争力的 ELISA,首先用 100 微升纯化抗原在 96 孔 ELISA 板上的孔中涂上 100 微升的纯化抗原,浓度为每毫升 1-10 微克。用粘合板盖盖住板,然后在 4 摄氏度下孵育过夜。之后,通过轻拂水槽上的板,从井中取出未结合的抗原溶液。

接下来,通过在PBS中为每个井中加入200微升的阻断缓冲液,阻断涂布井中剩余的蛋白质结合位点。在室温下孵育板至少2小时。在堵住油井时,将抗原抗体混合物制备为1。5毫升管,通过在测定中为每个井添加150微升样品抗原到150微升原抗体。在37摄氏度下孵育这种混合物1小时。现在,通过在水槽上轻拂板,从井中取出阻塞缓冲液。然后,用含有Tween 20的1X PBS清洗水井,然后加入100微升的抗原原抗体混合物样品。

让盘子在37摄氏度下孵育一小时。接下来,将板轻拂在水槽上,然后用含有 1% 补间-20 的 1X PBS 清洗孔,以去除任何未结合的抗体,从而去除样品混合物。在每个孔中加入100微升酶结合的二级抗体,并在37摄氏度的温度下孵育板一小时。之后,用含有1%补间-20的1X PBS清洗板,然后向每个孔中加入100微升的基板溶液。等待 5-10 分钟。10分钟后,加入100微升2N硫酸,停止酶反应,然后在加入停止溶液后的30分钟内测量微孔板读取器中的吸光度。

在半定量间接ELISA测定中,通过读取板读器中每口孔在405纳米处的吸光度,确定甲型流感病毒抗体在甲型流感小鼠血清序列稀释样本中的存在。此原始数据将导出到跨页工作表以进行计算。在这个实验中,连续稀释的血清样本,范围从1 - 12.5,到1 - 204,800,重复在三重。

因此,为了分析数据,通过添加每个稀释的所有值并将总和除以 3 来计算每组三元组的平均吸收率值。一旦确定每组三元数的均值,就针对串行稀释绘制平均 OD450 读数。随着血清被稀释,OD读数减少,表明在稀释程度较低的样品中发现的抗体较少。在定量三明治ELISA中,将已知标准的稀释物(本例中重组人类TNFalpha)添加到96孔板中,并与未知样品一起读取。

为了创建标准曲线,计算了已知浓度的每组读数的平均吸收率值。然后,在 y 轴上绘制平均吸收值,与 x 轴上的已知蛋白质浓度绘制。通过图形中的点添加最佳拟合曲线。

生成标准曲线后,通过首先计算测试样品的平均吸收值,可以确定测试样品中的 TNFalpha 蛋白质量。在此示例中,测试样本给出 OD450 读数为 0.636 和 0。681. 加上这些值,将总和除以2,平均为0.659。从标准曲线图上的 y 轴中,将水平线从此吸收值扩展到标准曲线。在交点,将一条垂直线延伸到 x 轴并读取相应的浓度,在此测试样本中,该浓度对应于每毫升 38.72 象形图的 TNFalpha 浓度。

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter