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ELISA Assays: Indirect, Sandwich, et Compétitif

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L'analyse immunosorbent liée à l'enzyme, ou ELISA est un essai quantitatif très sensible couramment utilisé pour mesurer la concentration d'un analyte comme les cytokines et les anticorps dans un échantillon biologique. Le principe général de cet essai comporte trois étapes : en commençant par la capture, ou l'immobilisation, de l'analyte cible sur une microplaque, suivie de la détection de l'analyte par des protéines de détection spécifiques à la cible, et enfin, de la réaction enzymatique, où un l'enzyme conjuguée convertit son substrat en un produit coloré. Basé sur différentes méthodes de capture et de détection, ELISA peut être de quatre types: direct, indirect, sandwich, et compétitif.

Pour l'ELISA directe, l'antigène cible est d'abord lié à la plaque, puis détecté par un anticorps de détection spécifique. Cette méthode est couramment utilisée pour le dépistage des anticorps pour un antigène spécifique. L'ELISA indirect est utilisé pour détecter les anticorps dans un échantillon afin de quantifier les réponses immunitaires. La plaque est d'abord recouverte d'un antigène de capture spécifique, qui immobilise l'anticorps cible, et ce complexe antigène-anticorps est ensuite détecté à l'aide d'un deuxième anticorps.

Dans le cas du sandwich ELISA, l'analyte cible est un antigène, qui est capturé sur la plaque à l'aide d'un anticorps de capture, puis détecté par l'anticorps de détection, formant ainsi un sandwich anticorps-anticorps-anticorps. Cette méthode est utile pour mesurer la concentration d'un antigène dans un échantillon mixte.

L'ELISA concurrentiel est utilisé lorsqu'un seul anticorps est disponible pour un antigène cible d'intérêt. La plaque est d'abord recouverte de l'antigène purifié. Pendant ce temps, l'échantillon contenant l'antigène est pré-incubé avec l'anticorps, puis ajouté à la plaque, pour permettre à toutes les molécules d'anticorps libres de se lier à l'antigène immobilisé. Plus le signal de la plaque est élevé, plus la concentration d'antigènes dans l'échantillon est faible. Dans les quatre types d'ELISA, directs, indirects, sandwich, et compétitif, l'anticorps de détection est soit directement conjugué à l'enzyme ou peut être indirectement lié à elle par un autre anticorps ou une protéine.

Les enzymes couramment utilisées pour la réaction sont le raifort peroxidase ou la phosphatase alcaline avec leurs substrats respectifs, produisant tous deux un produit soluble et coloré qui peut être mesuré et quantifié à l'aide d'un lecteur de plaques. Dans cette vidéo, vous observerez comment effectuer eLISA indirecte, sandwich ELISA, et ELISA concurrentiel, suivie par des exemples de quantification de l'analyte cible à partir des méthodes indirectes et sandwich ELISA.

La première expérience démontrera comment utiliser l'ELISA indirecte pour déterminer la présence d'anticorps antigrippaux dans le sérum obtenu à partir de souris infectées par la grippe.

Pour commencer, ajoutez 50 microlitres d'antigène purifié - dans ce cas, 2 milligrammes par millilitre de virus purifié de la grippe A/8- à chaque puits d'une plaque ELISA de 96 puits. Ensuite, recouvrir la plaque d'un couvercle adhésif et l'incuber toute la nuit à 4 degrés Celsius pour permettre à l'antigène de se lier à la plaque. Le lendemain, retirez la solution de revêtement en faisant glisser la plaque sur un évier. Ensuite, bloquez les autres sites de liaison protéinée dans les puits enduits en ajoutant 200 microlitres d'un tampon de blocage - ici, 5% sérum d'âne en 1X PBS - à chaque puits. Laisser l'assiette incuber pendant au moins 2 heures à température ambiante. Après l'incubation, retirez le tampon de blocage, puis lavez la plaque en ajoutant 200 microlitres de 1X PBS contenant 1% De Tween-20. Faites glisser la plaque sur l'évier une fois de plus pour enlever le lavage.

Ensuite, préparer les échantillons d'essai en ajoutant 460 microlitres de PBS à un tube frais, puis en ajoutant 40 microlitres de sérum pour faire une dilution de 1 à 12,5. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de PBS à un deuxième tube, puis ajoutez 100 microlitres de la première dilution. Poursuivez cette plage de dilution en série jusqu'à l'obtention d'un échantillon final avec une dilution de 1 à 204 800. Ajouter les échantillons de sérum dilués en série dans les puits. Couvrir la plaque d'un couvercle adhésif et incuber à température ambiante pendant une heure. Ensuite, retirez les échantillons en faisant glisser la plaque dans l'évier, puis lavez la plaque en ajoutant 200 microlitres de 1X PBS contenant 1% Tween-20. Encore une fois, faites glisser la plaque pour enlever le lavage.

Maintenant, ajoutez 100 microlitres d'un anticorps secondaire enzymatique, qui dans cette expérience est un peroxidase de raifort, ou HRP, l'âne conjugué anti-souris secondaire, à chaque puits. Incuber la plaque pendant une heure à température ambiante, et faire glisser la plaque pour enlever tout excès de liquide. Laver la plaque avec 1X PBS contenant 1% Tween-20, puis appliquer 100 microlitres du substrat indicateur à une concentration d'un milligramme par millilitre à chaque puits. Incuber la plaque avec le substrat pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Dans cet exemple, le substrat incolore 3,3', 5,5' - tetramethylbenzidine, ou TMB, devient une couleur bleue lorsque HRP est présent. Après 10 minutes, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 100 microlitres d'acide sulfurique 2N. Les échantillons tourneront d'une couleur jaune.

Dans les 30 minutes suivant l'ajout de la solution d'arrêt, insérez la plaque dans un lecteur de microplaque et lisez la plaque à la longueur d'onde appropriée pour le substrat afin de déterminer l'absorption des puits.

Pour commencer le sandwich ELISA, l'assiette doit être recouverte d'anticorps de capture purifiés. Pour ce faire, ajoutez 100 microlitres de l'anticorps de capture à une concentration dans la gamme de 1-10 microgrammes par millilitre, à chaque puits d'une plaque ELISA de 96 puits. Ensuite, couvrir la plaque d'un couvercle adhésif, puis incuber la plaque pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Après l'incubation, retirer la solution de revêtement en faisant glisser la plaque sur un évier.

Maintenant, bloquez les autres sites de liaison protéinée dans les puits enduits en ajoutant 200 microlitres de lait sec non gras de 5 % aux puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 2 heures. Ensuite, retirez le tampon de blocage, puis lavez les puits avec 1X PBS contenant 1% Tween-20. Retirez le lavage en faisant glisser la plaque sur l'évier. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de l'échantillon d'essai aux puits, scellez la plaque avec un couvercle adhésif, puis incubez-la à température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, retirer les échantillons en faisant glisser la plaque sur l'évier, puis laver les puits avec 200 microlitres de 1X PBS contenant 1% Tween-20. Faites glisser la plaque sur l'évier pour enlever le lavage, puis ajoutez 100 microlitres d'anticorps de détection conjugués en zymatiques aux puits.

Sceller la plaque avec un couvercle adhésif. Laisser l'assiette incuber à température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, retirez l'anticorps de détection non lié en faisant glisser la plaque sur un évier et lavez les puits avec 200 microlitres de 1X PBS contenant 1% de Tween-20. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du substrat indicateur à une concentration de 1 milligramme par millilitre, et incubez la plaque pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 100 microlitres d'acide sulfurique 2N aux puits, puis lire la plaque dans les 30 minutes suivant l'ajout de la solution d'arrêt dans un lecteur de microplaques.

Pour effectuer un ELISA compétitif, enrober d'abord les puits d'une plaque ELISA de 96 puits avec 100 microlitres d'antigène purifié à une concentration de 1-10 microgrammes par millilitre. Couvrir la plaque d'un couvercle adhésif, puis incuber toute la nuit à 4 degrés Celsius. Après cela, retirer la solution antigène non liée des puits en faisant glisser la plaque sur un évier.

Ensuite, bloquez les autres sites de liaison protéinée dans les puits enduits en ajoutant 200 microlitres de tampon de blocage à chaque puits ici, 5% de lait sec non gras dans PBS. Incuber la plaque pendant au moins 2 heures à température ambiante. Tout en bloquant les puits, préparer le mélange antigène-anticorps dans un 1. Tube de 5 millilitres en ajoutant 150 microlitres d'antigène d'échantillon à 150 microlitres d'anticorps primaires pour chaque puits dans l'essai. Incuber ce mélange pendant 1 heure à 37 degrés Celsius. Maintenant, retirez le tampon de blocage des puits en faisant glisser la plaque sur un évier. Ensuite, lavez les puits avec 1X PBS contenant Tween 20, puis ajoutez 100 microlitres de l'échantillon d'anticorps primaires antigène.

Laisser l'assiette incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, retirez le mélange d'échantillon en faisant glisser la plaque sur un évier, puis lavez les puits avec 1X PBS contenant 1% Tween-20 pour enlever tout anticorps non lié. Ajouter 100 microlitres d'un anticorps secondaire conjugué à l'enzyme à chaque puits et incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez la plaque avec 1X PBS contenant 1% Tween-20, puis ajoutez 100 microlitres de la solution de substrat à chaque puits. Attendez 5-10 minutes. Après 10 minutes, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 100 microlitres d'acide sulfurique 2N, puis mesurer l'absorption dans un lecteur de microplaque dans les 30 minutes suivant l'ajout de la solution d'arrêt.

Pour l'analyse indirecte semi-quantitative d'ELISA, la présence d'anticorps antigrippaux A dans des échantillons dilués en série de sérum de souris infectées par la grippe A a été déterminée en lisant l'absorption de chaque puits à 405 nanomètres dans un lecteur de plaque. Ces données brutes sont exportées vers une feuille de calcul à des fins de calcul. Dans cette expérience, les échantillons de sérum dilués en série, qui vont de 1 à 12,5, à 1 - 204 800, ont été répétés en triple.

Pour analyser les données, la valeur moyenne d'absorption est donc calculée pour chaque ensemble de triplicats en ajoutant toutes les valeurs pour chaque dilution et en divisant la somme par 3. Une fois que la moyenne pour chaque ensemble de triplicates est déterminée, les lectures Moyennes OD450 sont tracées contre les dilutions en série. Les lectures d'OD diminuent pendant que le sérum est dilué, indiquant que moins d'anticorps sont trouvés dans les échantillons plus dilués. Dans le sandwich quantitatif ELISA, des dilutions de norme connue, dans ce cas recombinate Human TNFalpha, ont été ajoutées à une plaque de 96 puits et lues avec les échantillons inconnus.

Pour créer la courbe standard, la valeur moyenne d'absorption pour chaque ensemble de lectures des concentrations connues a été calculée. Ensuite, la valeur moyenne d'absorption a été tracée sur l'axe y, contre les concentrations de protéines connues sur l'axe X. Une courbe de meilleur ajustement est ajoutée à travers les points du graphique.

Une fois la courbe standard générée, la quantité de protéine TNFalpha dans l'échantillon d'essai peut être déterminée en calculant d'abord la valeur moyenne d'absorption de l'échantillon d'essai. Dans cet exemple, les échantillons d'essai donnaient des lectures OD450 de 0,636 et 0. 681. L'ajout de ces valeurs et la division de la somme par 2 donne une moyenne de 0,659. De l'axe y sur le graphique de courbe standard, étendre une ligne horizontale de cette valeur d'absorption à la courbe standard. Au point d'intersection, étendre une ligne verticale à l'axe X et lire la concentration correspondante qui, dans cet échantillon d'essai, correspond à une concentration de TNFalpha de 38,72 picogrammes par millilitre.

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