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ELISA-Tests: Indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig

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Enzymgebundener Immunosorbent Assay oder ELISA ist ein hochempfindlicher quantitativer Test, der häufig verwendet wird, um die Konzentration eines Analyten wie Zytokine und Antikörper in einer biologischen Probe zu messen. Das allgemeine Prinzip dieses Assays umfasst drei Schritte: beginnend mit der Erfassung oder Immobilisierung des Zielanalyten auf einer Mikroplatte, gefolgt vom Nachweis des Analyten durch zielspezifische Detektionsproteine und schließlich der Enzymreaktion, bei der ein konjugiertes Enzym wandelt sein Substrat in ein farbiges Produkt um. Basierend auf verschiedenen Methoden der Erfassung und Detektion kann ELISA von vier Typen sein: direkt, indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig.

Bei direktem ELISA wird das Zielantigen zunächst an die Platte gebunden und dann durch einen bestimmten Detektionsantikörper nachgewiesen. Diese Methode wird häufig zum Screening von Antikörpern für ein bestimmtes Antigen verwendet. Indirekter ELISA wird zum Nachweis von Antikörpern in einer Probe verwendet, um Immunantworten zu quantifizieren. Die Platte wird zunächst mit einem spezifischen Aufnahmeantigen beschichtet, das den Zielantikörper immobilisiert, und dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird dann mit einem zweiten Antikörper nachgewiesen.

Bei Sandwich-ELISA ist das Zielanalyt ein Antigen, das mit einem Capture-Antikörper auf der Platte aufgenommen und dann vom Detektionsantikörper erfasst wird und somit ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Sandwich bildet. Diese Methode ist nützlich, um die Konzentration eines Antigens in einer gemischten Probe zu messen.

Competitive ELISA wird verwendet, wenn nur ein Antikörper für ein Zielantidem von Interesse verfügbar ist. Die Platte wird zuerst mit dem gereinigten Antigen beschichtet. In der Zwischenzeit wird die Probe, die das Antigen enthält, mit dem Antikörper vorinkubiert und dann der Platte zugesetzt, damit freie Antikörpermoleküle an das immobilisierte Antigen binden können. Je höher das Signal von der Platte, desto niedriger ist die Antigenkonzentration in der Probe. Bei allen vier Arten von ELISA, direkt, indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig, wird der Nachweisantikörper entweder direkt mit dem Enzym konjugiert oder kann indirekt durch einen anderen Antikörper oder ein anderes Protein mit ihm in Verbindung gebracht werden.

Die für die Reaktion gebräuchlichen Enzyme sind Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase mit ihren jeweiligen Substraten, die beide ein lösliches, farbiges Produkt produzieren, das mit einem Plattenleser gemessen und quantifiziert werden kann. In diesem Video werden Sie beobachten, wie indirekte ELISA, Sandwich-ELISA und wettbewerbsfähiger ELISA ausgeführt werden, gefolgt von Beispielen für die Quantifizierung des Zielanalyten aus den indirekten und Sandwich-ELISA-Methoden.

Das erste Experiment wird zeigen, wie indirektes ELISA verwendet wird, um das Vorhandensein von Anti-Influenza-Virus-Antikörpern in Serum zu bestimmen, die von influenzainfizierten Mäusen gewonnen werden.

Zunächst 50 Mikroliter gereinigtes Antigen - in diesem Fall 2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes A/PR/8 Influenza-A-Virus - zu jedem Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte hinzufügen. Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius, damit sich das Antigen an die Platte bindet. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben. Als nächstes blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie 200 Mikroliter eines Sperrpuffers - hier 5% Eselserum in 1X PBS- zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie die Platte mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer und waschen Sie die Platte, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS hinzufügen, die 1% Tween-20 enthalten. Streichen Sie die Platte noch einmal über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen.

Bereiten Sie dann die Testproben vor, indem Sie 460 Mikroliter PBS in ein frisches Rohr geben und dann 40 Mikroliter Serum hinzufügen, um eine Verdünnung von 1 bis 12,5 zu erzielen. Dann fügen Sie 300 Mikroliter PBS zu einem zweiten Rohr hinzu, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der ersten Verdünnung hinzu. Setzen Sie diesen seriellen Verdünnungsbereich fort, bis sie eine endgültige Probe mit einer Verdünnung von 1 bis 204.800 erhalten. Fügen Sie die seriell verdünnten Serumproben in dreifacher Auslage zu den Brunnen hinzu. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und brüten Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte in die Spüle streichen und dann die Platte waschen, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS hinzufügen, die 1% Tween-20 enthalten. Streichen Sie erneut die Platte, um die Wäsche zu entfernen.

Fügen Sie nun 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers hinzu, der in diesem Experiment eine Meerrettichperoxidase oder HRP, konjugierte Esel-Anti-Maus-Sekundär, zu jedem Brunnen ist. Inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei Raumtemperatur, und flicken Sie die Platte, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Waschen Sie die Platte mit 1X PBS mit 1% Tween-20 und wenden Sie dann 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf jeden Brunnen auf. Inkubieren Sie die Platte mit dem Substrat für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. In diesem Beispiel wird das farblose Substrat 3,3', 5,5' - Tetramethylbenzidin oder TMB, Substrat, eine blaue Farbe, wenn HRP vorhanden ist. Nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion beenden, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure hinzufügen. Die Proben werden eine gelbe Farbe.

Innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung, legen Sie die Platte in einen Mikroplattenleser und lesen Sie die Platte bei der entsprechenden Wellenlänge für das Substrat, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.

Um mit dem Sandwich-ELISA zu beginnen, muss die Platte mit gereinigtem Capture-Antikörper beschichtet werden. Dazu fügen Sie 100 Mikroliter des Capture-Antikörpers in einer Konzentration im Bereich von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte hinzu. Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebeplattenabdeckung und bebrüten die Platte dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.

Blockieren Sie nun die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie 200 Mikroliter 5% fettfreie Trockenmilch in die Brunnen geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer, und waschen Sie dann die Brunnen mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten. Entfernen Sie die Wäsche, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen. Fügen Sie nun 100 Mikroliter der Probe in die Brunnen, versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach der Inkubation entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen und dann die Brunnen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen. Streichen Sie die Platte über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen und fügen Sie dann 100 Mikroliter enzymkonjugierten Detektionsantikörper in die Brunnen.

Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den ungebundenen Detektionsantikörper, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben und die Brunnen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats bei einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Platte für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure in die Brunnen geben und dann die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung in einem Mikroplattenleser lesen.

Um einen wettbewerbsfähigen ELISA durchzuführen, beschichten Sie zunächst die Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikroliter gereinigtem Antigen in einer Konzentration von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeplattenabdeckung und bebrüten Sie dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend die ungebundene Antigenlösung aus den Brunnen, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.

Als nächstes blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter Sperrpuffer hinzufügen- hier 5% fettfreie Trockenmilch in PBS. Inkubieren Sie die Platte für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur. Während der Blockierung der Brunnen, bereiten Sie die Antigen-Antikörper-Mischung in einem 1. 5 Milliliter Tube durch Zugabe von 150 Mikroliter n. Antigen probe zu 150 Mikroliter Primärantikörper für jeden Brunnen im Test. Inkubieren Sie diese Mischung für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nun den Sperrpuffer aus den Brunnen, indem Sie die Platte über eine Spüle schieben. Dann waschen Sie die Brunnen mit 1X PBS enthaltenTween 20 und fügen Sie dann 100 Mikroliter der Probe Antigen-Primär-Antikörper-Mischung.

Lassen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde bebrüten. Als nächstes entfernen Sie die Probenmischung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken streichen und dann die Brunnen mit 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Platte für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Danach waschen Sie die Platte mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthält, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu. Warten Sie 5-10 Minuten. Beenden Sie nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure hinzufügen und messen Sie dann die Absorption in einem Mikroplattenleser innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung.

Für den semiquantitativen indirekten ELISA-Test wurde das Vorhandensein von Influenza-A-Virus-Antikörpern in seriell verdünnten Serumproben von Influenza-A-infizierten Mäusen bestimmt, indem die Absorption jedes Brunnens bei 405 Nanometern in einem Plattenleser gelesen wurde. Diese Rohdaten werden zu Berechnungszwecken in ein Spreadsheet exportiert. In diesem Experiment wurden die seriell verdünnten Serumproben, die von 1 - 12,5 bis 1 - 204.800 reichen, in Dreifacher Ausführung wiederholt.

Um die Daten zu analysieren, wird der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Triplicaten berechnet, indem alle Werte für jede Verdünnung addiert und die Summe durch 3 dividiert wird. Sobald der Mittelwert für jeden Satz von Triplicaten bestimmt ist, werden die mittleren OD450-Messwerte gegen die seriellen Verdünnungen dargestellt. Die OD-Werte nehmen ab, wenn das Serum verdünnt wird, was darauf hindeutet, dass in den verdünnteren Proben weniger Antikörper gefunden werden. Im quantitativen Sandwich-ELISA wurden Verdünnungen bekannter Standards, in diesem Fall rekombinantes Human TNFalpha, einer 96-Well-Platte zugesetzt und zusammen mit den unbekannten Proben gelesen.

Um die Standardkurve zu erstellen, wurde der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Messwerten der bekannten Konzentrationen berechnet. Anschließend wurde der mittlere Absorptionswert auf der y-Achse gegen die bekannten Proteinkonzentrationen auf der x-Achse dargestellt. Eine optimale Anpassungskurve wird durch die Punkte im Diagramm hinzugefügt.

Sobald die Standardkurve erzeugt ist, kann die Menge des TNFalpha-Proteins in der Testprobe durch erste Berechnung des mittleren Absorptionswertes für die Testprobe bestimmt werden. In diesem Beispiel ergaben die Testbeispiele OD450-Werte von 0,636 und 0. 681. Wenn man diese Werte addiert und die Summe durch 2 dividiert, ergibt sich ein Durchschnitt von 0,659. Von der y-Achse im Standardkurvendiagramm eine horizontale Linie von diesem Absorptionswert bis zur Standardkurve ausdehnen. Am Schnittpunkt eine vertikale Linie zur x-Achse ausdehnen und die entsprechende Konzentration ablesen, die in dieser Testprobe einer TNFalpha-Konzentration von 38,72 Piktogrammen pro Milliliter entspricht.

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