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ELISAアッセイ:間接、サンドイッチ、競争力

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酵素結合免疫吸着アッセイ、またはELISAは、一般的に生体試料中のサイトカインおよび抗体のような検体の濃度を測定するために使用される高感度の定量アッセイである。このアッセイの一般的な原理は、マイクロプレート上の標的アナリテの捕捉または固定化から始まり、その後、標的特異的検出タンパク質によるアナライトの検出、そして最後に酵素反応の3つのステップを含みます。共役酵素は、その基板を着色された製品に変換します。ELISAは、キャプチャと検出の異なる方法に基づいて、直接、間接的、サンドイッチ、および競争力の4種類にすることができます。

直接ELISAの場合、標的抗原は最初にプレートに結合し、次いで特定の検出抗体によって検出される。この方法は、一般的に特定の抗原に対する抗体のスクリーニングに使用される。間接ELISAは、免疫応答を定量するためにサンプル中の抗体を検出するために使用されます。プレートは、最初に標的抗体を固定化する特定の捕捉抗原でコーティングされ、この抗原抗体複合体は、第2の抗体を使用して検出されます。

サンドイッチELISAの場合、標的解体は抗原であり、捕捉抗体を用いてプレート上で捕捉され、検出抗体によって検出され、したがって抗体抗体抗体サンドイッチを形成する。この方法は、混合試料中の抗原の濃度を測定するのに有用である。

競合ELISAは、目的とする標的抗原に対して1つの抗体のみが利用可能な場合に使用されます。プレートは、最初に精製抗原でコーティングされます。一方、抗原を含む試料は、抗体で予めインキュベートし、次いでプレートに添加し、任意の遊び物抗体分子が固定化抗原に結合することを可能にする。プレートからのシグナルが高いほど、試料中の抗原濃度は低くなります。ELISAの4種類の全てにおいて、直接的、間接的、サンドイッチ、および競争力のある検出抗体は、酵素に直接結合されるか、または別の抗体またはタンパク質を介して間接的にそれに連結することができる。

反応に一般的に使用される酵素は、それぞれの基質を有するホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼであり、いずれもプレートリーダーを用いて測定および定量することができる可溶性の着色製品を産生する。このビデオでは、間接ELISA、サンドイッチELISA、および競合ELISAを実行する方法を観察し、その後、間接的およびサンドイッチELISA法からターゲットアナリテの定量例を示します。

最初の実験では、間接的なELISAを使用して、インフルエンザ感染マウスから得られた血清中の抗インフルエンザウイルス抗体の存在を決定する方法を示します。

まず、精製抗原の50マイクロリットルを追加します - この場合、精製されたA/PR/8インフルエンザAウイルスの1ミリリットル当たり2ミリグラム-96ウェルELISAプレートの各ウェルに。次に、粘着カバーでプレートを覆い、抗原がプレートに結合できるように、一晩4°Cでインキュベートします。翌日、プレートをシンクの上にフリックしてコーティング液を取り除きます。次に、コーティングされたウェル内の残りのタンパク質結合部位を遮断し、ブロッキングバッファーの200マイクロリットルを追加して、各ウェルに1X PBSで5%ロバ血清を加える。プレートを室温で少なくとも2時間インキュベートします。インキュベーションに続いて、ブロッキングバッファーを取り出し、1%Tween-20を含む1X PBSの200マイクロリットルを加えてプレートを洗浄する。プレートをシンクの上にもう一度フリックして、洗浄を取り除きます。

次に、460マイクロリットルのPBSを新鮮なチューブに加え、40マイクロリットルの血清を加えて1~12.5希釈して試験サンプルを調べます。次いで、300マイクロリットルのPBSを第2のチューブに加え、次いで最初の希釈の100マイクロリットルを加える。このシリアル希釈範囲を1~204,800の希釈で最終的なサンプルを得るまで続けます。連続して希釈された血清サンプルをウェルに三つ三つ加えます。粘着カバーでプレートを覆い、室温で1時間インキュベートします。次に、プレートをシンクにフリックしてサンプルを取り出し、1%のTween-20を含む1X PBSの200マイクロリットルを追加してプレートを洗浄します。もう一度、プレートをフリックして洗浄を取り除きます。

さて、この実験では、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはHRPである酵素共役二次抗体の100マイクロリットルを各ウェルに加えます。室温でプレートを1時間インキュベートし、プレートをフリックして余分な液体を除去します。1%のTween-20を含む1X PBSでプレートを洗浄し、各ウェルに1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で指標基板の100マイクロリットルを適用します。室温で5~10分間基板でプレートをインキュベートします。この例では、無色3,3'、5,5'-テトラメチルベンジジン、またはTMBは、HRPが存在すると基板が青色に変わります。10分後、2N硫酸の100マイクロリットルを添加して酵素反応を停止する。サンプルは黄色に変わります。

ストップ溶液を添加してから30分以内に、プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、基板の適切な波長でプレートを読み取り、ウェルの吸光度を決定します。

サンドイッチELISAを開始するには、プレートを精製捕捉抗体でコーティングする必要があります。これを行うには、捕捉抗体の100マイクロリットルを1ミリリットル当たり1〜10マイクログラムの範囲内の濃度で、96ウェルELISAプレートの各ウェルに添加する。次に、粘着プレートカバーでプレートをカバーし、4摂氏で一晩プレートをインキュベートします。インキュベーション後、プレートをシンクの上にフリックしてコーティング溶液を取り除きます。

さて、5%の非脂肪ドライミルクの200マイクロリットルをウェルに加えることによって、コーティングされたウェル内の残りのタンパク質結合部位をブロックします。プレートを室温で少なくとも2時間インキュベートします。次に、ブロッキングバッファを取り外し、1%のTween-20を含む1X PBSでウェルを洗浄します。洗面台の上でプレートをフリックして洗浄を取り外します。さて、試験サンプルの100マイクロリットルを井戸に追加し、粘着カバーでプレートを密封し、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、シンクの上にプレートをフリックしてサンプルを除去し、1%のTween-20を含む1X PBSの200マイクロリットルでウェルを洗浄します。洗面台の上にプレートをフリックして洗浄を取り除き、100マイクロリットルの酵素共役検出抗体をウェルに追加します。

粘着カバーでプレートを密封します。プレートを室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートをシンク上でフリックして非結合検出抗体を取り出し、1%Tween-20を含む1X PBSの200マイクロリットルでウェルを洗浄します。次に、1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で指標基板の100マイクロリットルを追加し、室温で5~10分間プレートをインキュベートします。10分後、ウェルに2N硫酸の100マイクロリットルを加えて酵素反応を停止し、マイクロプレートリーダーにストップ溶液を加えてから30分以内にプレートを読み取ります。

競争力のあるELISAを実行するには、まず1ミリリットル当たり1〜10マイクログラムの濃度で精製抗原の100マイクロリットルで96ウェルELISAプレートのウェルをコーティングします。粘着板カバーでプレートを覆い、4°Cで一晩インキュベートします。この後、シンクの上にプレートをフリックして、ウェルから結合されていない抗原溶液を取り除きます。

次に、200マイクロリットルのブロッキングバッファーを各ウェルに加えることによって、被覆ウェル内の残りのタンパク質結合部位をブロックし、PBSで5%の非脂肪ドライミルクを各ウェルに加えます。プレートを室温で少なくとも2時間インキュベートします。ウェルを遮断しながら、抗原抗体混合物を1に調製する。5ミリリットルチューブは、アッセイ中の各ウェルに対して150マイクロリットルの一次抗体に150マイクロリットルのサンプル抗原を添加することにより用いる。この混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、プレートをシンクの上にフリックして、ウェルからブロッキング バッファを取り外します。次に、Tween 20を含む1X PBSでウェルを洗浄し、次に試料抗原-一次抗体混合物の100マイクロリットルを添加する。

プレートを放置し、1時間37°Cでインキュベートします。次に、シンクの上にプレートをフリックしてサンプル混合物を除去し、1%Tween-20を含む1X PBSでウェルを洗浄し、結合されていない抗体を除去します。各ウェルに100マイクロリットルの酵素共役二次抗体を加え、37°Cで1時間プレートをインキュベートします。この後、1%のTween-20を含む1X PBSでプレートを洗浄し、各ウェルに基板溶液の100マイクロリットルを追加します。5~10分待ちます。10分後、2N硫酸の100マイクロリットルを加えて酵素反応を停止し、停止溶液を添加してから30分以内にマイクロプレートリーダー内の吸光度を測定する。

半定量的間接ELISAアッセイの場合、インフルエンザA感染マウス由来の血清の連続希釈サンプル中のインフルエンザAウイルス抗体の存在は、プレートリーダー内の405ナノメートルで各井戸の吸光度を読み取ることによって決定した。この生データは、計算目的でスプレッドシートにエクスポートされます。この実験では、1~12.5~1~204,800の連続希釈血清試料を三重に繰り返した。

したがって、データを分析するために、各希釈のすべての値を加算し、合計を 3 で除算することにより、三量体の各セットに対して平均吸光度値が計算されます。三量体の各セットの平均が決定されると、平均 OD450 読み取り値がシリアル希釈に対してプロットされます。血清が希釈されるにつれてOD測定値が減少し、より希釈されたサンプルに含まれる抗体が少ないことを示す。定量サンドイッチELISAにおいて、既知の標準の希釈は、この場合ヒトTNFalphaを組換え、96ウェルプレートに添加し、未知のサンプルと共に読み取った。

標準曲線を作成するために、既知の濃度の読み取り値の各セットの平均吸光度値を計算した。次に、平均吸光度値をY軸上にプロットし、X軸上の公知のタンパク質濃度に対してプロットした。グラフ内の点を通して最適な適合曲線が追加されます。

標準曲線が生成されると、試験試料中のTNFalphaタンパク質の量は、まず試験試料の平均吸光度値を計算することによって決定することができる。この例では、テスト サンプルは 0.636 と 0 の OD450 読み取り値を与えました。681. これらの値を追加し、合計を 2 で除算すると、平均は 0.659 になります。標準カーブ グラフの Y 軸から、この吸光度値から標準カーブまで水平線を延長します。交点で、垂直線をX軸に延長し、対応する濃度を読み取り、この試験サンプルでは、1ミリリットル当たり38.72ピコグラムのTNFalpha濃度に対応する。

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