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Ensayos elISA: Indirecto, Sandwich y Competitivo

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Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, o ELISA es un ensayo cuantitativo altamente sensible comúnmente utilizado para medir la concentración de un analito como citoquinas y anticuerpos en una muestra biológica. El principio general de este ensayo implica tres pasos: a partir de la captura, o inmovilización, del analito objetivo en una microplaca, seguido de la detección del analito por proteínas de detección específicas de la diana, y por último, la reacción enzimática, donde un enzima conjugada convierte su sustrato en un producto de color. Basado en diferentes métodos de captura y detección, ELISA puede ser de cuatro tipos: directo, indirecto, sándwich y competitivo.

Para ELISA directo, el antígeno objetivo se une primero a la placa y, a continuación, es detectado por un anticuerpo de detección específico. Este método se utiliza comúnmente para detectar anticuerpos para un antígeno específico. El ELISA indirecto se utiliza para detectar anticuerpos en una muestra con el fin de cuantificar las respuestas inmunitarias. La placa se recubre primero con un antígeno de captura específico, que inmoviliza el anticuerpo objetivo, y este complejo antígeno-anticuerpo se detecta utilizando un segundo anticuerpo.

En el caso del sándwich ELISA, el analito objetivo es un antígeno, que se captura en la placa utilizando un anticuerpo de captura y luego se detecta por el anticuerpo de detección, por lo tanto, formando un sándwich de anticuerpos anticuerpos. Este método es útil para medir la concentración de un antígeno en una muestra mixta.

ElISA competitivo se utiliza cuando solo hay un anticuerpo disponible para un antígeno objetivo de interés. La placa se recubre primero con el antígeno purificado. Mientras tanto, la muestra que contiene el antígeno se preincuba con el anticuerpo y luego se añade a la placa, para permitir que cualquier molécula de anticuerpo libre se una al antígeno inmovilizado. Cuanto mayor sea la señal de la placa, menor será la concentración de antígeno en la muestra. En los cuatro tipos de ELISA, directo, indirecto, sándwich y competitivo, el anticuerpo de detección se conjuga directamente con la enzima o puede estar indirectamente vinculado a ella a través de otro anticuerpo o proteína.

Las enzimas comúnmente utilizadas para la reacción son la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina con sus respectivos sustratos, ambos produciendo un producto soluble y coloreado que se puede medir y cuantificar utilizando un lector de placas. En este vídeo, observará cómo realizar ELISA indirecto, ELISA sándwich y ELISA competitivo, seguido de ejemplos de cuantificación del analito objetivo a partir de los métodos ELISA indirectos y sándwiches.

El primer experimento demostrará cómo utilizar ELISA indirecto para determinar la presencia de anticuerpos contra el virus de la gripe en suero obtenido de ratones infectados por la gripe.

Para empezar, añadir 50 microlitros de antígeno purificado - en este caso, 2 miligramos por mililitro de virus purificado A/PR/8 gripe A- a cada pozo de una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa con una cubierta adhesiva e incubarla durante la noche a 4 grados centígrados para permitir que el antígeno se adhiera a la placa. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero. A continuación, bloquee los sitios restantes de unión a proteínas en los pozos recubiertos añadiendo 200 microlitros de un buffer de bloqueo- aquí, 5% suero de burro en 1X PBS- a cada pocto. Deje que la placa se incuba durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo y luego lave la placa agregando 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. Deslice el plato sobre el fregadero una vez más para quitar el lavado.

Luego, prepare las muestras de prueba agregando 460 microlitros de PBS a un tubo nuevo, y luego agregando 40 microlitros de suero para hacer una dilución de 1 a 12.5. Luego, agregue 300 microlitros de PBS a un segundo tubo, y luego agregue 100 microlitros de la primera dilución. Continúe este rango de dilución en serie hasta obtener una muestra final con una dilución de 1 a 204.800. Agregue las muestras de suero diluidas en serie en triplicado a los pozos. Cubra la placa con una cubierta adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, retire las muestras moviendo la placa en el fregadero y luego lave la placa añadiendo 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. Una vez más, deslice el plato para quitar el lavado.

Ahora, agregue 100 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado en enzimas, que en este experimento es una peroxidasa de rábano picante, o HRP, conjugada burro anti-ratón secundario, a cada pozo. Incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente, y mueva la placa para eliminar cualquier exceso de líquido. Lavar la placa con 1X PBS que contiene 1% de Tween-20 y luego aplicar 100 microlitros del sustrato indicador a una concentración de un miligramo por mililitro a cada pocto. Incubar la placa con el sustrato durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. En este ejemplo, el incoloro 3,3', 5,5' - tetrametilbenzidina, o TMB, sustrato se convierte en un color azul cuando HRP está presente. Después de 10 minutos, detener la reacción enzimática añadiendo 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N. Las muestras se tornarán de color amarillo.

Dentro de los 30 minutos de la adición de la solución de parada, inserte la placa en un lector de microplacas y lea la placa en la longitud de onda adecuada para el sustrato para determinar la absorbancia de los pocillos.

Para comenzar el sándwich ELISA, la placa debe estar recubierta con anticuerpo de captura purificado. Para ello, añadir 100 microlitros del anticuerpo de captura a una concentración dentro del rango de 1-10 microgramos por mililitro, a cada pozo de una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa y luego incubar la placa durante la noche a 4 grados centígrados. Después de la incubación, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero.

Ahora, bloquee los sitios restantes de unión a proteínas en los pozos recubiertos añadiendo 200 microlitros de leche seca sin grasa al 5% de leche seca sin grasa a los pozos. Incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos 2 horas. A continuación, retire el búfer de bloqueo y, a continuación, lave los pozos con 1X PBS que contiene 1% Tween-20. Retire el lavado moviendo la placa sobre el fregadero. Ahora, agregue 100 microlitros de la muestra de prueba a los pozos, selle la placa con una cubierta adhesiva y luego incubarla a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, retire las muestras moviendo la placa sobre el fregadero y luego lave los pozos con 200 microlitros de 1X PBS que contienen 1% de Tween-20. Deslice la placa sobre el fregadero para eliminar el lavado y luego agregue 100 microlitros de anticuerpos de detección conjugados enzimáticos a los pozos.

Selle la placa con una cubierta adhesiva. Deje que el plato se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, retire el anticuerpo de detección sin ataduras moviendo la placa sobre un fregadero y lave los pozos con 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. A continuación, añadir 100 microlitros del sustrato indicador a una concentración de 1 miligramo por mililitro, e incubar la placa durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática añadiendo 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N a los pozos y luego lea la placa dentro de los 30 minutos de agregar la solución de parada en un lector de microplacas.

Para realizar un ELISA competitivo, primero cubra los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con 100 microlitros de antígeno purificado a una concentración de 1-10 microgramos por mililitro. Cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa y luego incubar durante la noche a 4 grados centígrados. Después de esto, retire la solución de antígeno sin ataduras de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero.

A continuación, bloquee los sitios restantes de unión a proteínas en los pozos recubiertos añadiendo 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pocal, aquí, 5% de leche seca sin grasa en PBS. Incubar la placa durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Mientras bloquea los pozos, prepare la mezcla de antígeno-anticuerpo en un 1. Tubo de 5 mililitros añadiendo 150 microlitros de antígeno de muestra a 150 microlitros de anticuerpos primarios para cada pozo en el ensayo. Incubar esta mezcla durante 1 hora a 37 grados centígrados. Ahora, retire el búfer de bloqueo de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero. A continuación, lave los pozos con 1X PBS que contenga Tween 20 y luego agregue 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios de antígeno de muestra.

Deje que la placa se incuba a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la mezcla de muestra moviendo la placa sobre un fregadero y luego lave los pozos con 1X PBS que contiene 1% de Tween-20 para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Añadir 100 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado en zimgidos a cada pocato e incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados. Después de esto, lave la placa con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 y luego agregue 100 microlitros de la solución de sustrato a cada poca. Espere 5-10 minutos. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática añadiendo 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N y luego mida la absorbancia en un lector de microplacas dentro de los 30 minutos de agregar la solución de parada.

Para el ensayo el ELISA indirecto semicuantitativo, la presencia de anticuerpos del virus de la gripe A en muestras de suero diluidas en serie de suero de ratones infectados por la gripe A se determinó leyendo la absorbancia de cada pocil a 405 nanómetros en un lector de placas. Estos datos sin procesar se exportan a una hoja de cálculo con fines de cálculo. En este experimento, las muestras de suero diluidas en serie, que van de 1 - 12,5, a 1 - 204.800, se repitieron por triplicado.

Para analizar los datos, el valor medio de absorbancia se calcula para cada conjunto de triplicados añadiendo todos los valores para cada dilución y dividiendo la suma por 3. Una vez que se determina la media para cada conjunto de triplicados, las lecturas medias de OD450 se trazan contra las diluciones en serie. Las lecturas de La DO disminuyen a medida que el suero se diluye, lo que indica que se encuentran menos anticuerpos en las muestras más diluidas. En el sándwich cuantitativo ELISA, las diluciones de estándar conocido, en este caso recombinate TNFalpha humano, se añadieron a una placa de 96 pocillos y se leyeron junto con las muestras desconocidas.

Para crear la curva estándar, se calculó el valor medio de absorbancia para cada conjunto de lecturas de las concentraciones conocidas. A continuación, el valor medio de absorbancia se trazaba en el eje Y, frente a las concentraciones de proteína conocidas en el eje X. Se añade una curva de mejor ajuste a través de los puntos del gráfico.

Una vez generada la curva estándar, la cantidad de proteína TNFalpha en la muestra de prueba se puede determinar calculando primero el valor medio de absorbancia para la muestra de prueba. En este ejemplo, las muestras de prueba dieron a OD450 lecturas de 0.636 y 0. 681. Añadir estos valores y dividir la suma por 2 da un promedio de 0,659. Desde el eje Y del gráfico de curva estándar, extienda una línea horizontal desde este valor de absorbancia hasta la curva estándar. En el punto de intersección, extienda una línea vertical al eje X y lea la concentración correspondiente que, en esta muestra de ensayo, corresponde a una concentración de TNFalpha de 38,72 picogramos por mililitro.

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