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EliSPOT Assay: Détection des splenocytes sécrétants IFN

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L'immunospot lié à l'enzyme, ou ELISPOT, est une méthode pour analyser la réponse immunitaire à un agent pathogène ou des dommages cellulaires. Il permet de quantifier l'activation de différentes cellules immunitaires en détectant des protéines spécifiques qu'elles sécrètent. Par exemple, ELISPOT est couramment utilisé pour mesurer les réponses des lymphocytes T lors de l'exposition à un antigène étranger en détectant les cytokines sécrétées.

Pour un analyse ELISPOT à base de cytokine, le processus commence par le revêtement d'une microplaque ELISPOT avec un anticorps de capture, qui est spécifique à la cytokine cible. Après le revêtement d'anticorps, les lymphocytes T sont ajoutés aux puits et stimulés par un agent externe, comme l'anticorps anti-CD3, par exemple. Les cellules sécrètent alors la cytokine cible, qui est immédiatement immobilisée par l'anticorps de capture. Puisque la protéine est capturée instantanément après la sécrétion des cellules vivantes, sans dilution ou dégradation, cet assay a une grande précision. Après l'immobilisation de la cytokine cible, un anticorps de détection est ajouté, qui se lie également à la cytokine capturée.

La technique ELISPOT peut également être utilisée pour quantifier la mémoire des cellules B après une infection ou une vaccination en analysant leur production d'anticorps spécifiques. Dans un ELISPOT à base d'anticorps, un antigène spécifique est utilisé au lieu d'un anticorps pour l'étape de capture, où l'antigène sera lié à la plaque, ou à l'étape de détection, où l'antigène détecte l'anticorps cible après la capture. Dans toutes les variations du processus, pour les lymphocytes T ou B, l'anticorps de détection ou l'antigène est biotinylated, ce qui lui permet de se lier à une enzyme de détection conjuguée à la streptavidine, comme le raifort peroxidase. Puis, sur l'ajout du substrat de la peroxidase, AEC, un précipité sombre et insoluble est produit. Ce précipité marque l'emplacement de la protéine capturée, et chaque cellule sécrétrice se traduit par un endroit visible, qui peut être quantifié à l'aide d'un lecteur ELISPOT ou d'un microscope. La taille des taches est une estimation relative de la quantité de protéines sécrétées dans chaque cellule. Cet analyse peut détecter les réponses immunitaires des cellules simples, même dans des sous-populations relativement petites de cellules sécrétrices, ce qui le rend utile pour étudier les réponses immunitaires au niveau cellulaire.

Dans cette vidéo, vous apprendrez à effectuer un analyse ELISPOT, puis quantifier les taches représentant les cellules sécrétrices.

Tout au long de l'expérience, assurez des conditions stériles en travaillant dans une hotte à débit laminaire et en portant des gants.

Tous les calculs de ce protocole sont basés sur le volume nécessaire pour une plaque de 96 puits.

Tout d'abord, diluer l'anticorps de capture anti-cytokine. Pour ce faire, transférer 10 millilitres de tampon dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette pour ajouter 10 microlitres d'un milligramme par millilitre d'anticorps monoclonal au tampon pour créer une solution avec une concentration finale d'un microgramme par millilitre. Ensuite, versez la solution d'anticorps de capture dans un réservoir stérile et, à l'aide d'une pipette multicanal, distribuez 100 microlitres dans chaque puits d'une plaque ELISPOT de 96 puits.

Couvrir la plaque d'un couvercle de plaque, sceller pour éviter l'évaporation, et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, découvrez la plaque ELISPOT dans le capot à débit laminaire. Invertis rapidement la plaque sur des lingettes stériles pour enlever la solution d'anticorps de capture de chaque puits. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 200 microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits. Cette étape bloquera la liaison non spécifique pendant l'assiduité. Remplacer le couvercle de la plaque et couver dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Pendant que la plaque est incubating, préparer une solution de mitogène 2X en ajoutant un microlitre de PMA et 20 microlitres d'ionomycine à 10 millilitres de milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 15 nanogrammes par millilitre PMA et une ionomycine micromolaire.

Les suspensions cellulaires des splenocytes de souris devraient également être préparées à ce moment dans une hotte stérile. À l'aide d'un microscope et d'un hémocytomètre, mesurez la concentration des cellules et ajustez le volume total jusqu'à ce qu'une concentration de deux millions de cellules par millilitre soit atteinte.

Une fois l'incubation terminée, inversion rapide de la plaque sur des lingettes stériles pour enlever le milieu de culture cellulaire de chaque puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution de stock de suspension cellulaire préparée aux puits de la rangée supérieure de la plaque ELISPOT. Configurez l'expérience en triple, de sorte que chaque type de cellule testé sera plaqué dans un ensemble de trois colonnes groupées. En dessous de cela, ajouter 100 microlitres de milieu de culture de cellules simples aux cinq rangées suivantes de la plaque, en dessous des lignes contenant la solution de stock cellulaire.

Ensuite, effectuez une dilution en série en pipetting 100 microlitres de la suspension cellulaire de la rangée supérieure dans la rangée directement ci-dessous, doucement pipetting la solution de haut en bas pour répartir uniformément les cellules. Répétez ce processus pour les rangées restantes, en déplaçant 100 microlitres de la ligne précédente à la ligne ci-dessous à chaque étape, en continuant jusqu'à ce que la cinquième rangée a été diluée en série. Quitter la sixième rangée avec le milieu de culture cellulaire seulement, pour servir de contrôle. Pour stimuler les cellules dans les puits expérimentaux de la plaque, ajouter 100 microlitres de la solution mitogène préparée aux suspensions cellulaires dans chaque puits de rangées une à cinq. Assurez-vous de quitter la sixième rangée, qui servira de contrôle, non stimulée. Remplacer le couvercle et couver la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 à 48 heures.

Préparer l'anticorps anticytokine dilué biotinylated. Tout d'abord, préparer 50 millilitres de diluant d'assay en ajoutant 5 millilitres de sérum bovin fœtal de 10% à 45 millilitres de PBS. Ensuite, diluer l'anticorps de détection à une concentration de 2 microgrammes par millilitre dans le diluant d'analyse. Aussi, préparer 20 à 25 millilitres de tampon de lavage à ce moment, en mélangeant 0,05% Tween-20 et PBS.

Une fois l'incubation terminée, décapiter la plaque et l'inverser rapidement pour enlever tout le liquide des puits. Laver la plaque en ajoutant environ 200 microlitres de tampon de lavage à chaque puits. Expulsez ce liquide en inversant rapidement et en faisant glisser la plaque sur un évier. Répétez ce processus quatre fois de plus pour un total de cinq lavages. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution d'anticorps de détection diluée à chaque puits, remplacez le couvercle et incubez à température ambiante pendant deux heures. Après l'incubation, expulser la solution d'anticorps de détection des puits de la plaque en inversant et en faisant glisser la plaque sur l'évier.

Comme auparavant, lavez la plaque cinq fois avec un tampon de lavage, en expulsant le liquide entre chaque lavage. Après le lavage final, préparer la solution de peroxidase de streptavidin-raifort en la diluant selon les instructions du fabricant. Ensuite, avec les puits de la plaque vide, ajouter 100 microlitres de streptavidin dilué- raifort peroxidase solution à chaque puits. Remettre le couvercle sur la plaque et couver à température ambiante pendant deux heures.

Après l'incubation, pas plus de 15 minutes avant l'utilisation, activez la solution de substrat AEC préfabriquée. Jeter le contenu des puits et laver la plaque cinq fois avec un tampon de lavage, comme avant. Ensuite, ajoutez immédiatement 100 microlitres de solution de substrat AEC préparée dans chaque puits. Laisser la plaque à température ambiante se développer pendant environ 10 à 20 minutes, tout en surveillant le développement des taches. Ces taches apparaîtront sous forme de petits cercles obscurcis à la surface des puits. Ensuite, arrêtez la réaction en rinçant la plaque avec de l'eau et en la faisant glisser sur l'évier. Blot l'assiette sur des essuie-tout et laisser sécher à l'air pendant la nuit ou jusqu'à ce qu'elle soit complètement sèche. L'enlèvement du plateau en plastique sous la plaque facilitera le séchage. Après le séchage, les taches sont prêtes à être comptées avec un lecteur de plaque automatisé.

Ici, le lecteur CTL ImmunoSpot est utilisé, mais ce protocole peut être adapté pour n'importe quel lecteur. Ensuite, ouvrez le programme CTL et cliquez sur Scan Count. Poussez l'éjectisme pour que le plateau s'étende de la machine. Ensuite, retirez l'adaptateur en plastique et alignez la rangée A sur la plaque et l'adaptateur ELISPOT. Choisissez un nom de fichier et l'emplacement pour que le fichier soit enregistré et chargez la plaque et l'adaptateur sur le plateau. Cliquez sur Charger sur le logiciel et fermez la porte sur le côté de la machine. Ensuite, appuyez sur Démarrer après le comptage. Assurez-vous que le fichier est enregistré, puis ouvrez le logiciel Quality Control QC pour analyser les données et compter le nombre de points. Exportez ces données en tant que fichier Excel. Une fois l'analyse terminée, cliquez sur Eject pour récupérer la plaque.

Dans cette expérience, des cellules de type sauvage et de souris tumorales ont été plaquées et analysées pour le gamma IFN. Notez que le nombre de taches diminue avec la diminution de la concentration cellulaire. En règle générale, les données ELISPOT sont présentées comme le nombre de nombres de taches par nombre de cellules plaquées. Dans cet exemple, le nombre de taches a été affiché dans un graphique à barres, chaque concentration cellulaire respective étant répertoriée sur l'axe X. Notez que le nombre de taches indique le nombre de cellules activées par nombre total de cellules dans une population donnée.

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