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免疫组织化学和免疫细胞化学:通过光显微镜进行组织成像
 

免疫组织化学和免疫细胞化学:通过光显微镜进行组织成像

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免疫细胞化学和免疫组织化学是培养细胞和组织中感兴趣的蛋白质的染色方法。两种相关技术的基本原理是使用与检测系统标记的特定抗体来识别和可视化蛋白质,并确定其在细胞和组织内的位置以及相对水平。两个实验中的过程都从样品制备开始。

免疫细胞化学,专门可视化细胞中的蛋白质或抗原位置,这涉及三个步骤。第一步是电镀,这需要培养生长介质中的细胞在盖滑或滑动,通常,在培养板的井。其次是固定,在细胞中加入一种沉淀或交联剂(如甲醛),以保持蛋白质的结构完整性,防止酶活性降解。最后一步是渗透,这涉及添加洗涤剂,使细胞膜渗透的染色。

在对应方法中,免疫组织化学、蛋白质或抗原在组织中可视化,样品制备有五个步骤。首先,整个组织被固定,通常与甲醛。然后,将组织嵌入石蜡块中,然后用一种称为微体机的机器分割这个块,将组织切成薄片,可以放置在幻灯片上。接下来,对幻灯片进行脱蜡,或从组织切片周围去除石蜡。然后,可以执行可选的抗原检索步骤。这既可以用热或酶来揭开在固定过程中交联的表位,使它们可用于抗体结合。适当的样品制备后,将目标特异性原抗体添加到细胞或组织样本中。这种初级抗体应与感兴趣的蛋白质结合。接下来,添加二级抗体,检测并结合原抗体。这种二次抗体与一种称为HRP的酶结合,或可以结合。当添加其特定的基板 DAB 时,HRP 将其转换为不溶性棕色沉淀物。这个棕色的污渍标志着目标蛋白的位置。幻灯片还沾染了血氧素,将原子核标为蓝色,并为确定亚细胞定位提供空间参考点。之后,安装介质将添加到幻灯片中,然后加盖滑移,以密封和保存染色样品。最后,可以在光学显微镜上成像幻灯片。

在本视频中,您将观察镀层细胞和组织部分的样品制备技术,然后对组织部分进行免疫染色。

首先,感兴趣的细胞需要坐在盖玻片上。为此,在组织培养罩中工作,将单个盖玻片放入 24 孔板的井中。然后,关闭窗框并打开紫外线,对盖玻片进行至少 15 分钟的消毒。接下来,关闭紫外线。要将感兴趣的细胞从10厘米的培养皿中抬起,吸气介质,用PBS短暂清洗,并将胰蛋白酶加入细胞2分钟。然后,点击板的一侧,确保细胞已分离,并用介质中和胰蛋白酶。接下来,添加 0。5 mL 的电池悬浮液进入每个孔中,确保盖住盖玻片。将板放入加湿的 CO2 培养箱中,让细胞在 37 摄氏度下生长,直到它们汇合 50-70%。

一旦细胞达到最佳汇合,从每个孔中吸出培养基,然后通过在中孵育细胞来固定细胞。在室温下,在1X PBS中稀释5mL4%的甲醛20分钟。去除固定剂后,冲洗细胞在每个盖玻片上添加1mL的1X PBS。立即吸出 PBS,然后重复冲洗 2 次,共洗 3 次。

现在,通过在 1X PBS 中向每个井中添加 0.5 mL 的 0.1% Triton X-100 来渗透细胞。将盘子在室温下保持15分钟。吸气缓冲液,然后通过在每个井中加入1mL的1X PBS来冲洗细胞。立即吸出 PBS 并重复冲洗 2 次,共洗 3 次。现在,盖玻上的细胞是固定和渗透的,继续为以下免疫组织化学示例演示的染色程序,但孵育应在 24 孔板的孔内进行而不是直接在组织部分幻灯片上。

首先,获得准备好的、正式固定的石蜡嵌入组织部分。将幻灯片放入滑架中,然后完全浸入 250 mL 的 100% 二甲苯中,从而对幻灯片进行脱脂。让幻灯片在二甲苯中孵育5分钟。然后,从容器中取出幻灯片,用纸巾擦去,然后放入新的二甲苯浴中,再放入一个新鲜的容器中 5 分钟。

接下来,从100%乙醇开始,在一系列分级乙醇溶液中重新水化各部分3分钟。用纸巾擦拭滑架,并将幻灯片转移到 100% 乙醇的新容器中再工作 3 分钟。继续这个循环的洗涤,用纸巾干燥,并在指定时间内按照指示的乙醇浓度将滑梯转移到新的浴缸中。最后一次乙醇清洗后,用纸巾擦去机架,在室温下用100 mL的0.3%过氧化氢孵育幻灯片30分钟,以阻止任何内源性过氧化物酶活性。在 250 mL 的 1X PBS 中清洗幻灯片 5 分钟。在新鲜 1X PBS 的容器中重复洗涤 5 分钟。

接下来,通过将 IHC 青基酸盐缓冲液中的 250 mL 中滑片浸入 pH 6.0 中,然后煮沸 20 分钟,执行抗原回收。然后,继续染色协议。

要开始 IHC 的染色过程,请用疏水笔圈出各部分,以确定缓冲液需要覆盖的最小面积。然后,使用移液器放置100微升的阻塞缓冲液,这在这个实验中是马血清稀释在1XPBS,在部分。在室温下孵育幻灯片1小时。之后,使用移液器移除阻塞缓冲区。

接下来,通过在1X PBS中稀释的990微升马血清,在1:100稀释时稀释原抗体并阻断缓冲液。5 mL Eppendorf管,然后是10微升的原发抗体。在每个部分加入100微升稀释的原抗体,并在室温下孵育幻灯片30分钟。当计时器响起时,将原抗体从每张幻灯片上排出,然后在 250 mL 的 1X PBS 中洗涤 5 分钟。使用新鲜的 1X PBS 再次重复此洗涤。

当幻灯片在1X PBS中洗涤时,通过在1.5 mL管中加入995微升的阻断缓冲液,然后加入5微升的二级抗体,将二次抗体稀释至1:200稀释,在这种情况下,这是生物酸淡马抗小鼠IGG。在每个部分加入100微升稀释的二级抗体,然后在室温下孵育幻灯片30分钟。30分钟后,将二级抗体从部分中排出,然后在250 mL的1X PBS中清洗幻灯片5分钟。使用新鲜的 1X PBS 重复此洗涤。

现在,加入100微升的阿丁-生物锡复合试剂,在室温下在黑暗中孵育30分钟。接下来,将幻灯片浸入 1X PBS 的 250 mL 中,洗涤 5 分钟。与以前的洗涤步骤类似,使用新鲜的 1X PBS 再次重复此洗涤。接下来,通过在 100 微升 DAB 中孵育各部分长达 5 分钟来开发幻灯片。将部分浸在 250 mL 蒸馏水中 5 分钟,停止开发。

现在,如果需要,可以对幻灯片进行反染色。为此,在 250 mL 的哈里斯赫马图林溶液中短暂浸入幻灯片。将滑片在 250 mL 蒸馏水中洗涤 5 分钟,冲洗掉污渍。使用新鲜的蒸馏水再重复1次洗涤。接下来,使部分脱水。为此,首先用95%乙醇孵育幻灯片5分钟。将幻灯片放在纸巾上,再将它们转移到新鲜 95% 乙醇的新容器中再多 5 分钟。继续循环清洗,用纸巾打上印迹,并将幻灯片转移到新浴缸,按照所示溶液各5分钟。

完成孵育后,用纸巾将幻灯片斑点,然后将一滴安装介质(如有机体-柠檬山)添加到幻灯片中。现在,在各部分放置一个盖玻片,注意不要捕获气泡。现在,这些幻灯片已准备就绪,可在显微镜下进行分析。

要观察染色部分,请使用标准光学显微镜来可视化污渍,使用数码相机来捕捉图像。在这个IHC的这一特殊例子中,比较了来自野生型和自发性、双转基因或DTG小鼠的脾组织,用于研究淋巴瘤中的Dyclin D1表达。组织被石蜡嵌入,切片,并沾染抗环素D1抗体,并成像在20倍放大倍数。Cyclin D1 表达细胞在蓝色组织背景上由红褐色表示。比较不同小鼠图像中的染色强度,无论小鼠基因型如何,未放大的脾脏的Cyclin D1表达量都相对较低。相比之下,DTG小鼠的脾脏增大,显示红褐色染色增加,表明此小鼠模型中的癌症发育与Cyclin D1表达之间存在相关性。

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