Overview
מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד1,2,ויטני סוונסון2,3ותומאס ס. גריפית'1,2,3,4
1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
נוגדנים פוליקלונליים מוגדרים כאוסף של נוגדנים המכוונים נגד דטרמיננטים אנטיגניים שונים של אנטיגן או מספר אנטיגנים (1). בעוד נוגדנים פוליקלונליים הם כלים רבי עוצמה לזיהוי מולקולות ביולוגיות, יש מגבלה חשובה אחת - הם אינם מסוגלים להבחין בין אנטיגנים החולקים דטרמיננטים אנטיגניים. לדוגמה, כאשר אלבומין סרום בקר משמש לחיסון בעל חיים, תאי B עם משטח שונה Ig יגגיב דטרמיננטים אנטיגניים שונים על אלבומין סרום בקר. התוצאה היא תערובת של נוגדנים באנטיריום. מכיוון שארבומין בסרום בקר חולק כמה אפיטופים עם אלבומין בסרום אנושי באזורים השמורים אבולוציונית של החלבון, זה סרום אנטי-בקר אלבומין אנטי-וירוס יגיב גם עם אלבומין סרום אנושי. לכן, תרופה זו לא תהיה שימושית להבחנה בין אלבומינים של בקר וסרום אנושי.
מספר גישות ננקטו כדי להתגבר על בעיית הספציפיות של אנטי-זירה פוליקלונלית. האחת היא על ידי ספיגת הנוגדנים הלא רצויים על ידי העברת האנטי-אנרגיה דרך עמוד כרומטוגרפיה של אנטיגנים משותקים (2). שיטה זו היא מייגע ולעתים קרובות לא מסוגל להסיר לחלוטין את הנוגדנים לא רצויים. גישה נוספת היא לבודד תאי B בודדים המייצרים נוגדנים ולהרחיב אותם בתרבית. עם זאת, כמו רוב התאים הרגילים ללא תימוץ, תאי B אינם שורדים בתרבית ארוכת טווח.
כדי להתגבר על חוסר היכולת של תאי B לשרוד בתרבות, גישה אחת היא להכין היברידית של תאי מיאלומה-B. בשנת 1847, הנרי בנס-ג'ונס גילה כי חולים עם מיאלומה נפוצה, גידול לימפואידי, ייצרו כמות גדולה של נוגדנים (3). תאי B בחולים אלה הפכו ממאירים וגדלים ללא שליטה. מכיוון שתאי B הממאירים נגזרים משיבוט יחיד, הם זהים ומייצרים רק סוג אחד של נוגדן (כלומר,נוגדן חד שבטי, או mAb). עם זאת, רוב תאי מיאלומה אלה מייצרים נוגדנים של פרטים לא ידועים. בשנת 1975, על ידי היתוך תא מיאלומה לתא B, הצליחו סזאר מילשטיין וז'ורז ' קולר לייצר הכלאה שניתן לתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה ומייצרת מספר בלתי מוגבל של נוגדנים חד שבטיים של ייחודיות אנטיגנית ידועה (4). הרציונל מאחורי הגישה שלהם הוא לשלב את המאפיינים האלמותיים של תא המיאלומה ואת הנוגדן המייצר תכונות של תא B. הטכניקה שלהם חוללה מהפכה בייצור הנוגדנים ומספקת אמצעי רב עוצמה לזיהוי וטיהור של מולקולות ביולוגיות באמצעות נוגדנים חד שבטיים.
בדרך כלל, הכנת נוגדן חד שבטי דורשת מספר חודשים. ההליך הכללי כולל את השלבים הבאים:
- חיסון וסינון של טיטר נוגדנים
- היתוך של תאי B המייצרים נוגדנים ותאי מיאלומה
- צמיחה סלקטיבית של ההיברידית
- הקרנת ההיברידיות לייצור הנוגדן החד שבטי הרצוי
- שיבוט על ידי הגבלת דילול - תהליך לפיו תאים מדוללים לריכוז כדי לאפשר סטטיסטית פחות מתא אחד להתווסף לבארות של צלחת 96-well. כמה בארות בסופו של דבר עם 0 תאים וחלקם יהיו 1 תא. בארות עם זרעים עם תא אחד בסופו של דבר יגדלו לתוך אוכלוסייה חד שבטית של תאים.
- צמיחת ההיברידיות והכנת נוגדן חד שבטי
פרוטוקול זה מתמקד בשלב האחרון - צמיחת ההיברידיות והכנת הנוגדן המונוקלונלי. הנוגדן מטוהר מן התרבות supernatant על ידי משקעים אמוניום גופרתי (המכונה לעתים קרובות מלח החוצה) - שיטה נפוצה של הסרת חלבונים מפתרון. חלבונים בתמיסה יוצרים קשרי מימן, יחד עם אינטראקציות הידרופיליות אחרות, עם מים דרך הקבוצות הקוטביות והאיוניות החשופות שלהם. כאשר מוסיפים ריכוזים של יונים קטנים וטעונים מאוד (כגון אמוניום או סולפט), קבוצות אלה מתחרות עם החלבונים לקשירה למים. זה מסיר את מולקולות המים מן החלבון ומקטין את המסיסות שלה, וכתוצאה מכך משקעים של החלבון.
Procedure
הערה: טכניקת תרבית תאים סטרילית צריכה להישמר בעת טיפול בתאי ההיברידימה ובמדיה באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית) עד לצעדי טיהור הנוגדנים.
1. הפשרת תאי היברידיה קפואים
- לדגור על הוויאל המכיל את תאי ההיברידיומה הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרה (כ-2 דקות).
- הוסף את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של RPMI מלא (RPMI בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 100 פניצילין U /mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1mM נתרן pyruvate, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1200 סל"ד כדי לשטוף את כל אמצעי ההקפאה המזהמים.
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant נוזלי, ו resuspend גלולה התא 5 מ"ל טרי להשלים RPMI. לאחר מכן, הוסף את התאים לבקבוק תרבית רקמות T75 המכיל RPMI מלא של 15 מ"ל (נפח סופי של RPMI הוא 20 מ"ל).
- לגדל את התאים באינקובטור סטנדרטי ב 37 °C עם 5% CO2. תאים אינם דבקים בזמן שהם נמצאים בתרבית.
2. הרחבת הכלאה
- אפשר לתאים להתרחב במשך כ -3 ימים עד הבקבוקון הוא ~ 80% confluent.
הערה: כמות זו של זמן יכולה להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים, כמו גם הבדלים מובנים בשיעורי הצמיחה של תאים שונים. חשוב שתאים יהיו בשלב הצמיחה המעריכי. - ברגע הבקבוקון הראשוני מגיע ~ 80% השפעה, להסיר את התאים מבקבוק T75 הראשוני הזה, למקם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט ספין (1200 סל"ד במשך 5 דקות) כדי כדורי התאים.
- resuspend התאים ב 6 מ"ל של RPMI מלא, ולאחר מכן להפיץ את ההשעיה התא לשלושה צלוחיות T75 חדשות (2 מ"ל / בקבוקון המכיל RPMI 18 מ"ל). לדגור אלה שלושה צלוחיות T75 ב 37 °C עם 5% CO2 עד שהם ~ 80% confluent (זה צריך לקחת כ 3 ימים).
3. ייצור נוגדנים במדיום ללא סרום
הערה: בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את צמיחתם במדיום נטול סרום המיועד לצמיחה של קווי תאים היברידיים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במדיום הנוזלי HB Basal המוכנים לשימוש וזמינים מסחרית המכילים את מוצר תוספת HB101.
- התאים מכל אחד משלושת צלוחיות T75 (ב-80% זיהום) נאספים וצנטריפוגות (1200 סל"ד למשך 5 דקות).
- כדור התא מכל בקבוקון T75 הוא resuspended 10 מ"ל בתוספת HB101 סרום בינוני ולאחר מכן הוסיף שני T225 צלוחיות בתוספת HB101 בינוני ללא סרום (כלומר 5 מ"ל השעיית תא לתוך כל אחד 6 צלוחיות המכיל ~ 220-240 מ"ל HB101 בכל בקבוק).
- המשך לגדל את התאים בבקבוקי T225 ו- HB101 ב- 37°C עם 5% CO2 במשך שלושה שבועות, או עד שתאים מתחילים למות. התאים מייצרים mAb במהלך 3 השבועות האלה ומפרשים אותו למדיום התרבותי. ברגע שהתאים מתחילים למות, הם כבר לא מייצרים mAb.
4. טיהור נוגדנים - יום 1
הערה: בשלב זה, אין צורך לשמור על סטריליות ולכן אין צורך בטיפול בתקשורת באופן סטרילי (למשל, בארון בטיחות ביולוגית). יתר על כן, הכלאות אינן נחשבות לסוכן "רמת BSL2".
- יוצקים מדיה מהבקבוקונים לצינורות לרוטור בזווית קבועה. לסובב את הצינורות בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 10,000 סל"ד במשך 8 דקות. שלב זה נועד להסיר את הפסולת התאית מן לתרבות-על.
הערה: גדלי הצינור יכולים להשתנות בהתאם לרוטור המשמש. הדבר החשוב לזכור הוא לקבל את אותו נפח בצינורות כדי להבטיח את הרוטור מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סביר להניח שכל נפח המדיה לא יתאים לצנטריפוגה בבת אחת. שאר אמצעי התקשורת יצופו מאוחר יותר (שלב 4.5) באמצעות אותם צינורות. - הכן פלסטיק 2L עם בר ערבוב בדלי מוקף קרח. מניחים על צלחת ערבוב.
- צרף חלק עליון מסנן 500 מ"ל על בקבוק 1L. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות צינורות מתאימים.
- יוצקים את supernatant מ שלב 4.1 (אשר עדיין מכיל את mAb המיוצר על ידי תאי hybridoma) לתוך החלק העליון של המסנן.
- המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי גלולה פסולת תא מהמדיה (הכדור ימשיך לבנות). המתן להפעלת הוואקום עד שראש המסנן יהיה מלא וקבוצה נוספת של סופר-נט-נט מוכנה לשפוך פנימה. אל תתנו למסנן להתייבש או שהסינון יהפוך לאיטי מאוד.
- כאשר בקבוק 1L קרוב למלא, להסיר את החלק העליון מסנן ולשפוך supernatant לתוך 2L כף מוכנה בשלב 4.2. א'א',ח'י את החלק העליון של המסנן. עקוב אחר אמצעי האחסון.
- חזור על שלבי המרכז והסינון עד שכל המדיה מעובדת.
- למדוד 295 גרם של אמוניום גופרתי לכל 1L של סופרנאט מסונן שנאסף. תוך כדי ערבוב, לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות (~ 25 גרם כל 15 דקות) כדי למנוע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז.
- לאחר הוספת כל האמוניום גופרתי, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים עם צלחת הערבוב ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, מקרר או חדר קר). מערבבים לילה. ערבוב מתמיד של הפתרון נדרש כדי solubilize המלח, אבל ערבוב ממושך יכול להוביל denaturation של חלבונים בתמיסה על פני השטח / ממשק האוויר.
- לשטוף את הצינורות באמצעות רוטור זווית קבועה.
5. טיהור נוגדנים - יום 2
- יוצקים את האמוניום-סולפט המכיל סופר-טבעי מהכוס 2L לתוך צינורות עבור רוטור זווית קבועה. ספין בצנטריפוגה עם רוטור זווית קבועה ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא בלם.
- ואקום לשאוף supernatant, דואג לא למצוץ את הכדור כפי שהוא יהיה רך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף גלולה מהאמוניום-גופרתי המכיל סופרנטנט.
- לאחר השאיפה האחרונה, resuspend כל גלולה (המכיל נוגדנים) ב ~ 1 מיליליטר PBS.
- הסר את אמוניום גופרתי מן פתרון mAb מזורז על ידי דיאליזה נגד כמויות גדולות של PBS. כדי לעשות זאת, לחתוך תחילה כ 1 אינץ 'של צינורות דיאליזה (למשל, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 דלתון מנותק צינורות דיאליזה תאית) עבור כל mL של פתרון mAb. הרטיבו את הצינורות עם dH2O. לקשור קשר בקצה אחד של הצינורות ולמלא עם dH2O כדי לבדוק את הקשר הזה לא דולף. ריק dH2O מהצינורות.
- פיפטה PBS / פתרון נוגדן לתוך הצינורות. לשטוף את הצינורות עם PBS נוסף 0.25 מ"ל, ולהעביר צינורות.
- אבטחו את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה כתום.
- הדבק את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של 4L. אפשר לחלק המלא של הצינורות להיתלות לתוך הכיס. ממלאים את הכיס ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב.
- מערבבים למשך הלילה כ-8 שעות ב-4°C.
- החליפו את ה-PBS בכורסה ב-PBS טרי וערבובו כ-8 שעות פעמיים נוספות.
- מעבירים את הנוגדן מהצינורות לצינורות חרוטים של 15 או 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו. מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי.
- לדלל aliquot של נוגדן 1:20 עם PBS (5 מיקרול נוגדן + 95 μl PBS). כמות ריכוז הנוגדנים עם ספקטרופוטומטר (ריק עם PBS) ב 280 ננומטר. השתמש במקדם הכחדה (ε) של 1.43. הריכוז מחושב כ
- Aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני בורג cap ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
נוגדנים הם כלי רב עוצמה למחקר ואבחון, כלומר לייצר אותם בכמויות גדולות הוא לעתים קרובות הכרחי.
הצעד הראשון ליצירת נוגדנים הוא להזריק את האנטיגן של עניין לתוך חיה מארחת. האנטיגן מפעיל את תאי B של המארח אשר לאחר מכן לייצר ולשחרר נוגדנים ספציפיים אנטיגן זה. לאחר מכן מתבצעת הקרנה סדירה של האנטיזרים של החיה המארחת לנוכחות נוגדן המטרה, באמצעות ELISA או שיטת זיהוי אחרת. ברגע שהוא מזוהה, הטחול של החיה המארחת, המכיל את תאי B, מוסר. אם כל תאי ה-B מהטחול מבודדים כעת, זה צריך לכלול אוכלוסייה שמפרישת נוגדנים לאנטיגן מעניין. אנו מתייחסים לאוכלוסייה זו כאל פוליקלונלית, מכיוון שכל תא ככל הנראה קשור לאפיטופ שונה של האנטיגן, ולכן, יצר נוגדן אישי וייחודי משלו.
כדי ליצור נוגדנים חד שבטיים, נוגדנים שהועלו כדי לזהות אפיטופ ספציפי אחד, תא B הבודד המייצר את הנוגדן הרצוי חייב להיות קודם כל מבודד ותרבית. למרבה הצער, תאי B אינם שורדים היטב בתרבות. אז כדי להתגבר על המשוכה הזו, מדענים משלבים תאי B עם תאי מיאלומה אלמותיים, וכתוצאה מכך הכלאיות. תאים אלה גדלים לאחר מכן במדיום סלקטיבי המאפשר רק hybridomas לגדול ולשחרר נוגדנים. שוב, המדיום מוקרן בשיטה כגון ELISA עבור הנוגדן הרצוי. ברגע שהוא מזוהה, ההיברידיומות משובטות באמצעות תהליך הנקרא הגבלת דילול, דילול סדרתי של תרבות האב, אשר אמור לגרום לתאים בודדים להיות זרע לתוך בארות של צלחת הקרנה. זה מאפשר צמיחה של הכלאה מתא חד הורי, מניב קו תאים חד שבטי המשחרר רק את הנוגדן הרצוי. קווים חד שבטיים אלה ניתן להרחיב צלוחיות תרבית רקמות כדי לייצר כמויות גדולות של נוגדנים חד שבטיים. לאחר מכן, כאשר התאים מתחילים למות, הנוגדנים יכולים להיות מזודקים מהמדיום עם אמוניום גופרתי. בדרך כלל, בתמיסה, נוגדנים אינטראקציה עם מים באמצעות אינטראקציות הידרופיליות. עם זאת, אמוניום וגופרית הם יונים טעונים מאוד המפרידים בין מולקולות המים לנוגדנים, מפחיתים את המסיסות של הנוגדנים וגורמים להם לזרז.
ראשית, בדוק תחילה את רשימת החומרים והכן את כל אמצעי התקשורת, האספקה ומשטחי העבודה עבור הפרוטוקול.
לאחר מכן, להפעיל אמבט מים ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של RPMI מלא לצינור חרוטי 15 מיליליטר ו 15 מיליליטר של RPMI מלא לבקבוק תרבות תא T75 ולהניח אותם בצד. תוך זהירות ולבוש את ציוד המגן האישי המתאים, הסר את ה- vial הקפוא המכיל תאי היברידיומה מאחסון החנקן הנוזלי. כדי לשחרר את הלחץ בתוך הקרבון, לשחרר את הכובע מעט. עכשיו, בזהירות לדגור על הנקינה באמבט המים, לוודא כי הכובע נשאר מעל פני המים כדי למזער את הסיכויים לזיהום. כאשר התאים כמעט מופשרים, אשר בדרך כלל לוקח בערך שתי דקות, להעביר את המשחקון למכסה המנוע תרבית הרקמות.
לאחר מכן, לנגב את החלק החיצוני של המשחקון עם 70% אתנול לפני הסרת המכסה. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר את התאים לתוך הצינור החרוט המכיל 10 מיליליטר של מדיום RPMI מלא. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 1200 סל"ד. לאחר צנטריפוגה, להזיז את הצינור בחזרה למכסה המנוע רקמה ולנגב את החלק החיצוני של הצינור עם אתנול. מבלי להפריע לכדור, להשליך את supernatant ולאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של RPMI מלא טרי בינוני בעדינות pipette למעלה ולמטה כדי resuspend. לאחר מכן, להעביר את התאים לבקבוקן תרבית התא T75 ולהניח את הבקבוק בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני 5% ב 37 מעלות צלזיוס. אפשר לתאים להגיע לכ -80% השפעה, אשר בדרך כלל לוקח כשלושה ימים. שים לב שתאי ההיברידיומה אינם תלויים ויגדלו מושעים במדיום. הזמן להגיע להשפעה מספקת עשוי להשתנות בהתאם למספר ההתחלתי של תאים חיים ולסוג תא ההיברידיומה המשמש.
ברגע התאים הם מספיק מזוהים, להשתמש פיפטה סטרילית 25 מיליליטר להעביר אותם מבקבוק התרבות לתוך צינור צנטריפוגה חרוט. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1200 סל"ד במשך חמש דקות. בעוד התאים נמצאים בצנטריפוגה, להוסיף 18 מיליליטר של RPMI מלא לתוך כל אחד משלושה צלוחיות תרבית תא T75 חדשים ולהניח אותם בצד. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant בעדינות resuspend את גלולה התא בשישה מיליליטר של RPMI מלא. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של השעיית התא לכל אחד משלושת צלוחיות תרבית התאים החדשות. לבסוף, מניחים את הבקבוקונים לתוך אינקובטור להגדיר 5% פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס ודגרה עד הבקבוקונים הם סביב 80% מפגש, כשלושה ימים.
בשלב זה, התאים מוכנים להמשיך את הצמיחה שלהם במדיום ללא סרום המיועד לקווי תאים היברידיים, כגון מדיום נוזל בזאלי HB זמין מסחרית המכיל את תוספת HB101. מעבירים את התאים מכל בקבוקון תרבית תא לצינורות צנטריפוגות חרוטיים ואז מנפחים את התאים בצנטריפוגה ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. עכשיו, להוסיף 230 מיליליטר של תוספת HB101 ללא סרום בינוני לתוך כל שישה 225 ס"מ בריבוע תרבית תרבית בקבוקים ולהניח אותם בצד. כאשר centrifugation הושלמה, להסיר את supernatant ו resuspend כל גלולה ב 10 מיליליטר של בינוני HB101 תוספת. לאחר מכן, לתוך כל בקבוקון תרבית תא, להוסיף חמישה מיליליטר של השעיית התא. מניחים את הבקבוקונים בחממה 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס ולהמשיך לגדל את התאים במשך כשלושה שבועות. במהלך תקופה זו, התאים ייצרו וישחררו את הנוגדן המונוקלונלי של עניין למדיום התרבותי והנוגדן יהיה מוכן לטיהור כאשר התאים יתחילו למות.
כדי להסיר את הפסולת התאית ממדיית התרבות המכילה נוגדנים, יוצקים את התוכן של צלוחיות התרבות לצינורות עבור רוטור בזווית קבועה. מניחים את הצינורות ברוטור ומוודאים שהוא מאוזן כראוי לפני צנטריפוגה. סובב את הצינורות במהירות של 10,000 סל"ד במשך שמונה דקות. בזמן שהדגימות צנטריפוגה, מניחים פלסטיק בשני ליטרים עם מוט מוקפץ לתוך דלי קרח ואז מניחים את דלי הקרח על צלחת ערבוב.
לאחר מכן, חברו מסנן 500 מיליליטר לבקבוק ליטר אחד. חברו את יחידת המסנן העליונה של הבקבוק לוואקום הביתי באמצעות הצינורות המתאימים. לאחר מכן, יוצקים את חומר העל המכיל את הנוגדן לחלק העליון של המסנן. צנטריפוגה התקשורת הנותרת כדי להפריד את פסולת התא מן הנוגדן המכיל סופרנט. כאשר החלק העליון של המסנן מלא בסופר-טבעי, התחל את הוואקום. לאחר מכן, כאשר בקבוק האוסף של ליטר אחד קרוב למלא, הסר את החלק העליון של המסנן ויוצק את supernatant מסונן לתוך כף שני ליטר על קרח. חזור על שלבי הסינון עד שכל סופר-נט יעובד.
כאשר כל המדגם עובד, לשקול 295 גרם של אמוניום גופרתי לליטר אחד של סופרנט מסונן. התחל את צלחת ערבוב לאט להוסיף את אמוניום גופרתי על-טבעי במהלך השעות הקרובות. זה מונע ריכוז גבוה מקומי של מלח אמוניום גופרתי שעלול לגרום חלבונים לא רצויים לזרז. לאחר שכל האמוניום גופרתי נוסף, מכסים את הכיס בנייר כסף ומעבירים אותה, יחד עם צלחת הערבוב, לחדר קר בארבע מעלות צלזיוס ומניחים אותה לערבב את תמיסת הנוגדנים בן לילה.
למחרת בבוקר, לשפוך את תמיסת נוגדן המכיל אמוניום גופרתי מן כף שני ליטר לתוך צינורות נקיים עבור רוטור זווית קבועה. צנטריפוגות הצינורות ב 6500 סל"ד במשך 20 דקות ללא הפסקה כדי כדורי הנוגדן בתחתית הצינורות. לאחר מכן, ואקום לשאוף supernatant, תוך זהירות לא למצוץ את הכדור הרך. המשך להשתמש באותה קבוצה של צינורות כדי לאסוף את הנוגדן כדורי משאר אמוניום גופרתי המכיל supernatant. לאחר השאיפה האחרונה, להשעות מחדש כל כדור נוגדן בערך מיליליטר אחד של PBS.
כדי להסיר את אמוניום גופרתי מתמיסת הנוגדנים, תחילה לחתוך כ סנטימטר אחד של צינורות דיאליזה עבור כל מיליליטר של פתרון נוגדנים. לאחר מכן, לנגב את הצינורות עם מים מזוקקים ולקשור קשר בקצה אחד של הצינורות. מלאו את הצינורות במים מזוקקים כדי לבדוק אם יש דליפה מהקשר. אם אין דליפה לאחר מספר דקות, רוקנו את המים מהצינורות.
לאחר מכן, צנרת פתרון הנוגדנים לתוך הצינורות. כדי לשחזר כמה שיותר נוגדנים, לשטוף את הצינורות עם 0.25 מיליליטר נוסף של PBS ולהעביר את זה צינורות גם. אבטח את החלק העליון של הצינורות קרוב ככל האפשר לפתרון עם קליפ דיאליזה. לאחר מכן, הדביקו את החלק העליון של הצינורות לחלק החיצוני של ארבעה ליטרים עם החלק המלא של הצינורות תלויים לתוך הכיס. עכשיו, קח את הכיס לחדר הקר של ארבע מעלות צלזיוס והנח אותו על צלחת ערבוב. ממלאים את הכיס למעלה ב-PBS ומוסיפים מוט ערבוב. אפשר הצינור ואת הפתרון לערבב לילה במשך כשמונה שעות. למחרת בבוקר, להחליף את PBS בכף עם PBS טרי ולאחר מכן להשאיר את הכיס לערבב שוב במשך כשמונה שעות. מאוחר יותר באותו ערב, חזור על התהליך בפעם האחרונה. בבוקר, לפתוח את צינור הדיאליזה ולאחר מכן להעביר את פתרון הנוגדנים מן הצינורות צינורות חרוט 15 מיליליטר. כדי להסיר כל משקעים שאולי נוצרו במהלך הדיאליזה, צנטריפוגה הצינורות במשך חמש דקות ב 1200 סל"ד. לבסוף, להעביר את supernatant לצינורות טריים.
כדי לכמת את ריכוז הנוגדנים, תחילה לעשות דילול פי 20 על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים מ aliquot נוגדן ל 95 microliters של PBS. לאחר מכן, pipette הנוגדן מדולל לתוך cuvette ולהשתמש ספקטרופוטומטר כדי לתעד את הריכוז ב 280 ננומטר. לאחר מכן, חשב את ריכוז הנוגדנים באמצעות הנוסחה המוצגת. לבסוף, תווית בורג מכסה בקבוקונים עם שם הנוגדן, ריכוז, תאריך ההכנה, ואם ישים, מספר אצווה ושם הנסיין, ולאחר מכן aliquot את הנוגדן לתוך בקבוקוני כובע בורג שכותרתו. אלה יכולים להיות מאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
דוגמה לתפוקות באמצעות קו היברידי 120G8 נגד עכבר CD317 או PDCA-1 היברידית נע בין 44 ל 99.6 מיליגרם, אשר בדרך כלל מניב, בממוצע, 67.3 מיליגרם כמות. חשוב לציין כי כל ייצור לרוץ עם אותו קו תא hybridoma יכול להיות שונה במקצת בכמות הנוגדן המונוקלונלי זמין בסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
באמצעות פרוטוקול זה, השגנו את התוצאות הבאות עם מספר הכלאות שונות:
הכלאה: RB6-BC5 (עכבר נגד עכבר Ly6C/ Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
מנת יתר280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15.42 מ"ג/מ"ל
הכלאה: GK1.5 (עכבר נגד עכבר CD4 IgG2b, κ mAb)
מנת יתר280 - 0.485
(0.485/1.43) (20) = 6.78 מ"ג/מ"ל
הכלאה: 2.43 (עכברוש נגד עכבר CD8 IgG2b, κ mAb)
מנת יתר280 - 0.209
(0.209/1.43) (20) = 2.92 מ"ג/מ"ל
כל אלה הן תוצאות לדוגמה, וחשוב לציין כי כל ייצור לרוץ עם אותה hybridoma יכול להיות שונה במקצת בכמות mAb זמין בסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
ההליך המתואר לעיל הוא דרך פשוטה וישירה קדימה לטהר נוגדנים חד שבטיים מתרבות היברידית. חשוב לזכור, עם זאת, כי אמוניום גופרתי יהיה לזרז חלבונים אחרים שעשויים להיות בתרבות supernatant. כתוצאה מכך, ריכוזי הנוגדנים שנקבעו ממדידות הספיגה הם הערכות. המשתמש עשוי לרצות להעריך את הטוהר של המדגם המחויג על ידי הפעלת כמות קטנה על ג'ל SDS-polyacrylamide. mAb המיוצר על ידי hybridoma, פעם מטוהר באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן להשתמש במגוון דרכים. RB6-BC5, GK1.5 ו- 2.43 mAb המתוארים לעיל משמשים בדרך כלל לדלדול ויואו של נויטרופילים, תא CD4 T ותאי CD8 T, בהתאמה, בעכברים. mAb אחרים המיוצרים ומטוהרים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש עבור cytometry זרימה (כאשר מצומד פלואורופור או בשילוב עם Ab משני), ELISA, או סופג מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
- Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
- Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
- Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).
