Overview
출처: 프랜시스 V. 자아스타드1,2,휘트니 스완슨2,3,토마스 에스 그리피스1,2,3,4
1 미생물학, 면역학 및 암 생물학 대학원 프로그램, 미네소타 대학교, 미니애폴리스, MN 55455
2 면역학 센터, 미네소타 대학, 미니애폴리스, MN 55455
3 미네소타 대학교 비뇨기과, 미니애폴리스, MN 55455
4 Masonic 암 센터, 미네소타 대학, 미니애폴리스, MN 55455
다각성 항체는 항원 또는 여러 항원(1)의 상이한 항원 결정제에 대하여 지시된 항체의 집합으로 정의됩니다. 다각성 항체는 생물학적 분자를 식별하기위한 강력한 도구이지만, 한 가지 중요한 한계가 있습니다 - 항원 결정제를 공유하는 항원을 구별 할 수 없습니다. 예를 들어, 소 혈청 알부민이 동물을 예방 접종하는 데 사용될 때, 다른 표면이 있는 B 세포는 소 세럼 알부민에 대한 상이한 항원 결정제에 반응하게 된다. 그 결과 항체의 혼합물이 항혈구에 혼합된다. 소 세럼 알부민은 단백질의 진화적으로 보존된 영역에서 인간 혈청 알부민과 일부 에피토페를 공유하기 때문에, 이 안티소빈 세럼 알부민 안티세럼은 또한 인간 혈청 알부민과 반응할 것이다. 따라서,이 항세럼은 소와 인간의 혈청 알부민을 구별하는 데 유용하지 않습니다.
다발성 항세라의 특이성 문제를 극복하기 위해 몇 가지 접근법이 취해졌습니다. 하나는 고정된 항원의 크로마토그래피 컬럼을 통해 항혈을 전달함으로써 원치 않는 항체를 흡수함으로써(2)이다. 이 방법은 지루하고 자주 완전히 원치 않는 항체를 제거 할 수 없습니다. 또 다른 접근법은 개별 항체 생산 B 세포를 분리하고 배양에서 확장하는 것입니다. 그러나, 대부분의 일반적인 변환되지 않은 세포같이, B 세포는 장기 배양에서 살아남지 않습니다.
배양에서 살아남기 위해 B 세포의 무능력을 극복하기 위해, 한 가지 방법은 골수종-B 세포 혼종을 준비하는 것이다. 1847년, 헨리 Bence-Jones는 림프성 종양인 다발성 골수종을 가진 환자가 다량의 항체(3)를 생산한다는 것을 발견했습니다. 이 환자에 있는 B 세포는 악성되고 통제할 수 없는 성장합니다. 악성 B 세포는 단일 클론으로부터 파생되기 때문에, 그들은 동일하고 항체의 단일유형(즉,단일 클론 항체 또는 mAb)만 생성한다. 그러나, 이러한 골수종 세포의 대부분은 알 수 없는 특이성의 항체를 생산. 1975년, 골수종 세포를 B 세포에 융합시킴으로써, 세자르 밀스타인과 조지 콜러는 시험관내에서 무기한 배양될 수 있는 혼종 생성에 성공하여 알려진 항원 특이성의 무제한 의 단일클론 항체를 생산한다(4). 그들의 접근의 뒤에 근거는 골수종 세포의 불멸의 속성 및 B 세포의 생성 하는 항체를 결합 하는. 그들의 기술은 항체 생산을 혁명화하고 단일 클론 항체를 사용하여 생물학적 분자의 식별 및 정화를위한 강력한 수단을 제공합니다.
일반적으로 단일 클론 항체를 준비하는 것은 몇 달이 필요합니다. 일반 절차에는 다음 단계가 포함됩니다.
- 항체 티터의 예방 접종 및 선별
- 항체 생성 B 세포 및 골수종 세포의 융합
- 혼종의 선택적 성장
- 원하는 단일 클론 항체를 생산하기위한 혼종 스크리닝
- 희석을 제한하여 복제 - 세포가 통계적으로 96웰 플레이트의 우물에 첨가될 1세포 미만을 허용하도록 농도로 희석되는 과정. 일부 우물은 0 세포로 끝나고 일부는 1 개의 세포가 있습니다. 1 세포와 함께 씨를 뿌렸던 우물은 결국 세포의 단일 클론 인구로 성장할 것입니다.
- 단일 클론 항체의 하이브리드 종의 성장 및 준비
이 프로토콜은 마지막 단계에 초점을 맞추고 - 혼성종의 성장과 단일 클론 항체의 준비. 항체는 암모늄 황산염 강수량(종종 염화아웃이라고도 함)에 의해 배양 상수로부터 정제된다 - 용액에서 단백질을 제거하는 일반적으로 사용되는 방법. 용액의 단백질은 노출된 극지 및 이온 그룹을 통해 물과 함께 다른 친수성 상호 작용과 함께 수소 결합을 형성합니다. 작고 고압이 많은 이온(예: 암모늄 또는 황산염)의 농도가 추가되면, 이들 그룹은 물에 결합하기 위한 단백질과 경쟁한다. 이것은 단백질에서 물 분자를 제거하고 그것의 용해도를 감소시켜 단백질의 강수량을 초래합니다.
Procedure
참고: 멸균 세포 배양 기술은 항체 정화 단계까지 혼성종 세포 및 미디어를 멸균 방식으로(예를 들어, 생물안전 캐비닛에서)로 처리할 때 유지되어야 한다.
1. 동결 된 혼종 세포를 해동
- 37°C 수조에서 냉동 혼종 세포를 함유한 바이알을 해동(약 2분)까지 배양합니다.
- 해동 된 세포를 완전한 RPMI10 mL (RPMI는 10 % 태아 소 세럼, 100 U /mL 페니실린, 100 μg /mL 연쇄 상감, 1mM 나트륨 pyruvate, 1x 비 필수 아미노산, 50 μ-10 μm)를 포함하는 15 mL 원추형 튜브에 추가하십시오.
- 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 오염된 동결 매체를 씻어낼 수 있습니다.
- 원심 분리 후 액체 상체를 버리고 5mL의 신선한 완전 RPMI로 셀 펠릿을 다시 분리하십시오. 이어서, 15mL 완전 RPMI를 함유하는 T75 조직 배양 플라스크에 세포를 추가한다(RPMI의 최종 부피는 20mL이다).
- 표준 인큐베이터에서 5% CO2로세포를 37°C에서 성장시면 됩니다. 세포는 배양에 있는 동안 비 신봉입니다.
2. 하이브리드종 확장
- 플라스크가 ~80% 컨실수 될 때까지 세포가 약 3일 동안 팽창하도록 합니다.
참고: 이 시간의 양은 세포의 시작 수에 따라 다를 수 있습니다., 다른 세포의 성장 속도에 내재 된 차이 뿐만 아니라. 세포가 기하급수적 성장 단계에 있는 것이 중요합니다. - 초기 플라스크가 ~80%의 합류에 도달하면, 이 초기 T75 플라스크에서 세포를 제거하고 원추형 원심분리기 튜브에 넣고 스핀(1200 RPM for 5분)을 사용하여 세포를 펠릿합니다.
- 완전한 RPMI의 6mL에서 세포를 다시 중단한 다음 셀 서스펜션을 3개의 새로운 T75 플라스크(18mL RPMI를 함유한 2mL/플라스크)로 분배한다. 이 세 개의 T75 플라스크를 37°C에서 5% CO2로 배양하여 ~80% 컨할 때까지 배양합니다(약 3일이 소요됩니다).
3. 세럼이 없는 매체의 항체 생산
참고: 이 시점에서, 세포는 혼종 세포주의 성장을 위해 설계된 혈청없는 매체에서 그들의 성장을 계속할 준비가 되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 HB101 보충 제품을 포함하는 즉시 사용 가능한 HB 기저 액체 매체를 사용합니다.
- 3개의 T75 플라스크(~80% 수렴)의 각각의 세포가 수집되고 원심분리(5분 동안 1200RPM).
- 각 T75 플라스크의 셀 펠릿은 10mL보충 HB101 세럼 프리 배지로 재주중단된 다음, 2개의 T225 플라스크보충 HB101 세럼 프리 배지(즉, 5mL 셀 서스펜션각각 ~220-240 mL HB101)를 함유하고 있다.
- 3주 동안 5%CO2로 T225 플라스크 및 HB101 미디어에서 세포를 계속 성장시키고, 세포가 죽기 시작할 때까지 계속 성장한다. 세포는 이 3 주 도중 mAb를 생성하고 배양 배지로 분비하고 있습니다. 세포가 죽기 시작하면 더 이상 mAb를 생성하지 않습니다.
4. 항체 정화 - 1일차
참고: 이 시점에서, 멸균은 유지될 필요가 없으므로 멸균 방식으로 미디어를 취급할 필요가 없습니다(예를 들어, 생물안전 캐비닛에서)는 필요하지 않다. 또한, hybridomas는 "BSL2 수준" 에이전트로 간주되지 않습니다.
- 고정 각도 로터를 위해 플라스크에서 미디어를 튜브에 붓습니다. 원심분리기에서 10,000 RPM의 고정 각도 로터로 튜브를 8분간 회전시합니다. 이 단계는 문화 상수에서 세포 이물질을 제거하도록 설계되었습니다.
참고: 튜브 크기는 사용되는 로터에 따라 다를 수 있습니다. 기억해야 할 중요한 것은 원심분리 전에 로터가 제대로 균형을 이루도록 튜브에 동일한 부피를 갖는 것입니다. 미디어의 전체 볼륨이 한 번에 원심분리기에 맞지 않을 가능성이 높습니다. 나머지 미디어는 동일한 튜브를 사용하여 나중에 원심 분리됩니다 (단계 4.5). - 얼음으로 둘러싸인 양동이에 스티어 바가 있는 2L 플라스틱 비커를 준비합니다. 교반 접시에 놓습니다.
- 1L 병에 500mL 필터 탑을 부착합니다. 적절한 튜브를 통해 진공을 수용하기 위해 병 상단 필터 장치를 부착하십시오.
- 4.1 단계 (여전히 하이브리드 종 세포에 의해 생성 된 mAb를 포함하는) 에서 상체를 필터 상단에 붓습니다.
- 동일한 튜브 세트를 사용하여 미디어에서 세포 이물질을 펠릿으로 계속 사용하십시오(펠릿은 계속 빌드됩니다). 필터 상단이 가득 차서 또 다른 상복부 배치가 쏟아질 준비가 될 때까지 진공을 실행하십시오. 필터를 건조시키거나 필터링이 매우 느려지게 하지 마십시오.
- 1L 병이 가득 차면 필터 상단을 제거하고 4.2 단계에서 준비된 2L 비커에 슈퍼나탄을 붓습니다. 필터 상단을 다시 연결합니다. 볼륨을 추적합니다.
- 모든 미디어가 처리될 때까지 원심분리 및 여과 단계를 반복합니다.
- 수집된 여과된 수퍼나탈의 1L당 295g의 황산암모늄을 측정합니다. 교반하는 동안, 앞으로 몇 시간(~25g마다 15분마다)에 걸쳐 상체에 황산암모늄을 천천히 추가하여 원치 않는 단백질이 침전될 수 있는 황산염의 국부화된 고농도를 방지합니다.
- 모든 암모늄 황산염이 추가되면 비커를 호일로 덮고 교반 판으로 4 °C (예 : 대형 냉장고 또는 차가운 방)로 이동하십시오. 하룻밤 저어주세요. 용액의 일정한 교반은 소금을 용해시키는 데 필요하지만, 장기간교반교는 표면/공기 인터페이스에서 용액에서 단백질의 저하로 이어질 수 있다.
- 고정 각도 로터를 사용하여 튜브를 세척합니다.
5. 항체 정화 - 2일차
- 2L 비커에서 상체가 함유된 암모늄-황산염을 튜브에 부어 고정 각도 로터를 넣습니다. 6500 RPM에서 6500 RPM의 고정 각도 로터로 원심분리기에서 브레이크 없이 20분 간 회전합니다.
- 진공 청소기는 부드러울 때 펠릿을 빨아들이지 않도록 주의하여 슈퍼에 흡인합니다. 동일한 튜브 세트를 사용하여 상체가 함유된 암모늄 황산염으로부터 펠릿을 수집합니다.
- 마지막 포부 후, 각 펠릿 (항체포함)을 ~1 ml PBS로 재보습하십시오.
- 많은 양의 PBS에 대한 투석에 의해 침전 된 mAb 용액에서 황산 암모늄을 제거하십시오. 이를 위해 먼저 mAb 솔루션의 각 mL에 대해 약 1인치의 투석 튜브(예: Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 달튼 컷오프 셀룰로오스 투석 튜브)를 잘라냅니다. 튜브를 dH2O. 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶고 dH2O로 채우기하여 매듭이 누출되지 않는지 확인합니다. 튜브에서 빈 dH2O.
- 파이펫 PBS/항체 용액을 튜브에 넣습니다. 0.25ml의 추가 로 튜브를 헹구고 튜브로 옮김합니다.
- 주황색 투석 클립으로 가능한 한 용액에 가깝게 튜브 상단을 고정합니다.
- 튜브 의 상단을 4L 비커의 외부 상단에 테이프. 튜브의 채워진 부분이 비커에 매달려 있도록 합니다. 비커를 PBS로 채우고 스터디 바를 추가합니다.
- 4°C에서 ~8시간 동안 밤새 저어줍니다.
- 비커의 PBS를 신선한 PBS로 교체하고 ~8시간 2회 더 저어줍니다.
- 항체를 튜브에서 15ml 또는 50ml 원문 튜브로 이송합니다. 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리기는 형성되었을 수 있는 침전을 제거합니다. 상체를 신선한 튜브로 옮기.
- PBS (5 μl 항체 + 95 μl PBS)로 항체 1:20의 알리쿼트희석. 280 nm에서 분광계(PBS를 가진 공백)로 항체 농도를 양수합니다. 1.43의 소멸 계수(ε)를 사용하십시오. 농도는
- 항체를 나사 캡 바이알에 알리쿼트와 -80°C에 보관합니다.
항체는 연구와 진단을 위한 강력한 공구입니다, 대량으로 그(것)들을 생성하는 것을 의미하는 것은 수시로 필요합니다.
항체를 생성하는 첫 번째 단계는 관심있는 항원을 숙주 동물에 주입하는 것입니다. 항원은 그 항원에게 특정한 항체를 생성하고 풀어 놓는 호스트의 B 세포를 활성화합니다. 이어서, 표적 항체의 존재를 위한 숙주 동물의 항세라의 정기적인 스크리닝이 실시되고, ELISA 또는 다른 검출 방법을 이용하여 수행된다. 일단 검출되면, B 세포를 포함하는 호스트 동물의 비장은 제거됩니다. 비장의 모든 B 세포가 지금 고립되는 경우에, 이것은 관심있는 항원에 항체를 분비하는 인구를 포함해야 합니다. 우리는 각 세포가 항원의 다른 에피토프에 묶여 있기 때문에 이 집단을 폴리클로날로 지칭하고, 따라서, 그 자체의 개별적이고 독특한 항체를 생성했다.
단일 클론 항체를 생성하기 위해, 하나의 특정 에피토프를 인식하기 위해 제기 된 항체, 원하는 항체를 생성하는 개별 B 세포는 먼저 단화되고 배양되어야한다. 불행히도, B 세포는 배양에서 잘 살아남지 못합니다. 따라서 이 장애물을 극복하기 위해 과학자들은 B 세포를 불멸의 골수종 세포와 융합하여 혼종을 생성합니다. 이 세포는 그 때 단지 hybridomas가 증가하고 항체를 풀어 놓는 것을 허용하는 선택적 매체에서 성장합니다. 다시, 배지는 원하는 항체에 대한 ELISA와 같은 방법을 사용하여 스크리징된다. 일단 검출되면, hybridomas는 단하나 세포가 스크리닝 플레이트의 우물으로 시드되는 귀착되어야 하는 부모 배양의 직렬 희석인 희석을 제한하는 프로세스를 통해 복제됩니다. 이것은 한부모 세포에서 혼종의 성장을 허용하고, 원하는 항체만 풀어 놓는 단클론 세포주 항복. 이러한 단일 클론 라인은 다량의 단일 클론 항체를 생산하기 위해 조직 배양 플라스크에서 확장 될 수있다. 그 후, 세포가 죽기 시작하면, 항체는 황산암모늄을 가진 배지로부터 침전될 수 있다. 일반적으로 용액에서 항체는 친수성 상호 작용을 통해 물과 상호 작용합니다. 그러나, 암모늄과 황산염은 항체로부터 물 분자를 분리하는 고충전 된 이온으로, 항체의 용해도를 감소시키고 침전시키는 원인이 된다.
먼저 재료 목록을 확인하고 프로토콜에 대한 모든 미디어, 소모품 및 작업 표면을 준비합니다.
그런 다음 수조를 켜고 섭씨 37도로 설정합니다. 다음으로, 15밀리리터 원추형 튜브에 10밀리리터의 완전한 RPMI와 완전한 RPMI 15밀리리터를 T75 세포 배양 플라스크에 추가하고 따로 둡니다. 주의와 적절한 개인 보호 장비를 착용, 액체 질소 저장에서 혼종 세포를 포함하는 냉동 유리병을 제거. 유리병 내부의 압력을 풀어 주려면 캡을 약간 느슨하게 합니다. 이제 수조의 유리병을 조심스럽게 배양하여 캡이 수면 위에 남아 오염 가능성을 최소화합니다. 세포가 거의 해동될 때, 전형적으로 약 2 분 소요되는, 조직 배양 후드에 유리병을 이동합니다.
그런 다음 캡을 제거하기 전에 70 % 에탄올로 바이알의 외부를 닦아냅니다. 멸균 파이펫을 사용하여, 완전한 RPMI 배지의 10 밀리리터를 포함하는 원적 튜브로 세포를 전송합니다. 그런 다음 1200 RPM에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 원심분리 후 튜브를 조직 후드로 다시 이동하고 에탄올로 튜브의 외부를 닦아냅니다. 펠릿을 방해하지 않고, 상체를 폐기한 다음 신선한 완전한 RPMI 배지 5 밀리리터를 넣고 부드럽게 파이펫을 위아래로 추가하여 다시 중단합니다. 다음으로, 세포를 T75 세포 배양 플라스크로 옮기고 플라스크를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터 안에 놓습니다. 세포가 약 80%의 합류에 도달할 수 있도록 하는데, 이는 보통 약 3일이 소요됩니다. 혼성종 세포는 부착되지 않으며 배지에서 일시 중단된 자랍니다. 충분한 합류에 도달하는 시간은 살아있는 세포의 시작 수와 사용되는 hybridoma 세포의 유형에 따라 달라질 수 있습니다.
세포가 충분히 수렴되면 멸균 25 밀리리터 파이펫을 사용하여 배양 플라스크에서 원추형 원심 분리튜브로 옮기십시오. 1200 RPM에서 원심분리로 세포를 5분 동안 펠렛합니다. 세포가 원심분리기에 있는 동안, 3개의 새로운 T75 세포 배양 플라스크의 각각에 완전한 RPMI의 18 밀리리터를 추가하고 따로 둡니다. 원심 분리 후, 상체를 제거하고 완전한 RPMI의 6 밀리리터에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다. 다음으로, 3개의 새로운 세포 배양 플라스크각각에 세포 현탁액의 2밀리리터를 추가합니다. 마지막으로 플라스크를 이산화탄소 5%, 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣고 플라스크가 약 3일 동안 약 80% 컨실수 될 때까지 배양합니다.
이 시점에서, 세포는 HB101 보충제를 함유하는 시판 가능한 HB 기저 액체 배지와 같은 혼종 세포주를 위해 설계된 혈청 없는 배지에서 성장을 계속할 준비가 되어 있다. 각 세포 배양에서 세포를 원추형 원심분리관으로 옮기고 5분 동안 1200 RPM에서 원심분리로 세포를 펠릿합니다. 지금, 6 개의 225 센티미터 제곱 세포 배양 플라스크의 각각에 보충 HB101 혈청 없는 매체의 230 밀리리터를 추가하고 따로 둡니다. 원심분리가 완료되면, 상체를 제거하고 보충 HB101 배지의 10 밀리리터에서 각 펠릿을 재연한다. 그런 다음, 각 세포 배양 플라스크에, 세포 현탁액의 5 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 5% 이산화탄소 인큐베이터에 섭씨 37도에 배치하고 약 3주 동안 세포를 계속 성장시십시오. 이 기간 동안, 세포는 세포가 죽기 시작하면 배양 배지로 관심 있는 단일클론 항체를 생성 및 방출할 것이며, 항체는 정화될 준비가 되어 있다.
항체 함유 배양 배지에서 세포 이물질을 제거하기 위해, 고정 각도 로터를 위해 배양 플라스크의 내용을 튜브에 붓습니다. 튜브를 로터에 놓고 원심 분리 전에 제대로 균형을 이루지 않도록 하십시오. 8 분 동안 10,000 RPM에서 튜브를 회전합니다. 샘플은 원심 분리하는 동안, 얼음 양동이에 교반 바가있는 2 리터 플라스틱 비커를 넣고 얼음 양동이에 얼음 양동이를 놓습니다.
다음으로 500밀리리터 필터 탑을 1리터 병에 부착합니다. 적절한 튜브를 사용하여 이 병 상단 필터 장치를 집 진공 상태에 부착합니다. 그런 다음, 필터 상단에 항체를 포함하는 상체를 붓는다. 잔류 된 매체를 원심 분리하여 세포 이물질을 항체 함유 상체로부터 분리한다. 필터 상단이 상수로 가득 차면 진공을 시작합니다. 그런 다음 1리터 컬렉션 병이 가득 차면 필터 상단을 제거하고 여과된 상체를 얼음 위에 2리터 비커에 붓습니다. 모든 상체가 처리될 때까지 여과 단계를 반복합니다.
모든 시료가 처리되면 여과 된 상체 1 리터 당 295 그램의 황산암모늄을 계량하십시오. 교반 판을 시작하고 천천히 다음 몇 시간 동안 상체에 황산 암모늄을 추가합니다. 이것은 원치 않는 단백질이 침전하는 원인이 될 수 있는 황산염의 국소화된 고농도를 방지합니다. 모든 암모늄 황산염이 추가되면 비커를 호일로 덮고 교반판과 함께 4도의 차가운 방으로 이동하여 밤새 항체 용액을 저어줍니다.
다음 아침, 2리터 비커에서 담근 앵글 로터에 대한 깨끗한 튜브에 2리터 비커에서 황산염 함유 항체 용액을 담급니다. 튜브의 바닥에 있는 항체를 펠렛하기 위해 휴식없이 20 분 동안 6500 RPM에서 튜브를 원심 분리합니다. 다음으로, 진공 청소기는 부드러운 펠릿을 빨아들이지 않도록주의를 기울여 슈퍼나탄을 흡인시합니다. 동일한 튜브 세트를 사용하여 황산염 함유 수퍼나탈탄의 나머지 부분에서 펠릿 항체를 수집합니다. 마지막 포부 후, PBS의 약 1 밀리리터에서 각 항체 펠릿을 다시 중단.
항체 용액에서 황산암모늄을 제거하기 위해 먼저 항체 용액의 각 밀리리터에 대해 약 1 인치의 투석 튜브를 잘라냅니다. 다음으로, 증류수로 튜브를 닦고 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶습니다. 매듭에서 누출을 확인하기 위해 증류수로 튜브를 채웁니다. 몇 분 후에 누출이 없는 경우 튜브에서 물을 비웁습니다.
다음으로, 항체 용액을 튜브에 파이펫합니다. 가능한 한 많은 항체를 복구하려면, PBS의 추가 0.25 밀리리터로 튜브를 헹구고 또한 튜브에 이것을 전송합니다. 투석 클립으로 가능한 한 용액에 가깝게 튜브 의 상단을 고정합니다. 그런 다음 튜브 의 상단을 4 리터 비커의 바깥쪽 상단에 테이프로 테이프로 붙이고 튜브의 채워진 부분이 비커에 매달려 있습니다. 이제 비커를 섭씨 4도 의 차가운 방으로 가져 가서 교반 접시에 놓습니다. 비커를 상단에 PBS로 채우고 스터디 바를 추가합니다. 튜브와 용액이 약 8시간 동안 밤새 저어줍니다. 다음 아침, 비커의 PBS를 신선한 PBS로 교체한 다음 비커를 떠나 약 8시간 동안 다시 저어줍니다. 그날 저녁, 마지막으로 프로세스를 반복합니다. 아침에 투석관을 열고 튜브에서 15밀리리터 원내 튜브로 항체 용액을 전달합니다. 투석 중에 형성되었을 수 있는 침전제를 제거하려면 1200 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 마지막으로, 상체를 신선한 튜브로 옮기.
항체 농도를 정량화하기 위해 먼저 항체 알리쿼트에서 PBS의 95 마이크로리터에 5개의 마이크로리터를 추가하여 20배 희석을 한다. 이어서, 희석된 항체를 큐벳으로 피펫하고 280나노미터의 농도를 기록하기 위해 분광계를 사용한다. 다음으로, 표시된 공식을 사용하여 항체 농도를 계산한다. 마지막으로, 항체 이름, 농도, 준비 날짜, 그리고 해당되는 경우 배치 번호 및 실험자 이름을 가진 라벨 스크류 캡 바이알을 부착한 나사 캡 바이알로 알리쿼트한다. 이 것들은 필요할 때까지 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.
120G8 항마우스 CD317 또는 PDCA-1 hybridoma 라인을 사용하여 예산출량은 44에서 99.6 밀리그램 사이로 배열되며, 이는 일반적으로 평균 67.3 밀리그램의 양을 산출합니다. 동일한 hybridoma 세포주를 가진 각 생산 실행은 끝에 유효한 단클론 항체의 양에서 약간 다를 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
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Results
이 프로토콜을 사용하여 다음과 같은 결과를 여러 가지 혼성종으로 얻었습니다.
하이브리드종: RB6-BC5 (쥐 안티 마우스 Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, θ mAb)
OD280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15.42 mg/mL
하이브리드종: GK1.5 (쥐 안티 마우스 CD4 IgG2b, θ mAb)
OD280 - 0.485
(0.485/1.43) (20) = 6.78 mg/mL
하이브리드종: 2.43 (쥐 안티 마우스 CD8 IgG2b, θ mAb)
OD280 - 0.209
(0.209/1.43) (20) = 2.92 mg/mL
이들은 모두 예제 결과이며, 동일한 hybridoma를 가진 각 생산 실행이 마지막에 유효한 mAb의 양에서 약간 다를 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
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Applications and Summary
위에서 설명한 절차는 혼종 배양 상수에서 단클론 항체를 정화하는 간단하고 직선적인 방법입니다. 하지만 황산암모늄은 문화상수퍼에 있을 수 있는 다른 단백질을 침전시킬 것이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, 흡광도 측정에서 결정된 항체 농도는 추정치이다. 사용자는 SDS-폴리아크라이글라미드 젤에 소량을 실행하여 투석된 샘플의 순도를 평가할 수 있다. 이 방법론을 사용하여 일단 정제된 혼성종에 의해 생성된 mAb는 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 전술한 RB6-BC5, GK1.5 및 2.43 mAb는 마우스에서 각각 호중구, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 생체 고갈에 일반적으로 사용된다. 이 프로토콜을 사용하여 제조 및 정제된 다른 mAb는 유동 세포측정(플루오로포어에 공인되거나 보조 Ab와 함께), ELISA 또는 서양 블로팅에 사용될 수 있다.
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References
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