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抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

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抗体は研究と診断のための強力なツールであり、多くの場合、大量に生産する必要があります。

抗体を生成する最初のステップは、目的の抗原を宿主動物に注入することです。抗原は宿主のB細胞を活性化し、その抗原に特異的な抗体を産生し放出する。そして、標的抗体の存在に対する宿主動物の抗セラの定期的なスクリーニングが行われ、ELISAまたは別の検出方法を用いて行われる。検出されると、B細胞を含む宿主動物の脾臓が除去される。脾臓からのすべてのB細胞が分離された場合、これは目的の抗原に抗体を分泌している集団を含むべきである。この集団は、各細胞が抗原の異なるエピトープに結合する可能性が高いため、独自の個体およびユニークな抗体を生成するため、ポリクローナルと呼ばれる。

モノクローナル抗体を生成するには、1つの特異的エピトープを認識するために挙げられた抗体を、所望の抗体を産生する個々のB細胞を最初に単離して培養しなければならない。残念ながら、B細胞は培養において十分に生き残れない。そこで、このハードルを克服するために、科学者はB細胞と不滅の骨髄腫細胞を融合させ、ハイブリドーマを生み出します。これらの細胞は、ハイブリドーマのみが抗体を増殖および放出することを可能にする選択的培地で増殖する。ここでも、培地は所望の抗体に対してELISAなどの方法を用いてスクリーニングされる。それが検出されると、ハイブリドーマは、親培養の連続希釈である希釈を制限するというプロセスを介してクローニングされ、単一細胞がスクリーニングプレートの井戸に播種されるはずです。これにより、単一の親細胞からのハイブリドーマの増殖が可能であり、所望の抗体のみを放出するモノクローナル細胞株が得られた。これらのモノクローナルラインは、組織培養フラスコ中に膨張し、大量のモノクローナル抗体を産生することができる。この後、細胞が死に始めると、抗体は硫酸アンモニウムを含む培地から沈殿させることができる。通常、溶液中では、抗体は親水性相互作用を介して水と相互作用する。しかし、アンモニウムと硫酸塩は、抗体から水分子を分離する高帯電イオンであり、抗体の溶解度を低下させ、沈殿させる原因となる。

まず、材料のリストを確認し、プロトコルのすべてのメディア、消耗品、および作業面を準備します。

次に、水風呂の電源を入れ、摂氏37度に設定します。次に、15 ミリリットルの円錐チューブに 10 ミリリットルの完全な RPMI を追加し、完全な RPMI を 15 ミリリットルの完全な RPMI を T75 細胞培養フラスコに追加し、それらを脇に置きます。注意を使用し、適切な個人用保護具を着用し、液体窒素貯蔵からハイブリドーマ細胞を含む凍結バイアルを除去する。バイアル内部の圧力を解放するには、キャップを少し緩めます。今、慎重に水浴中のバイアルをインキュベートし、キャップが汚染の可能性を最小限に抑えるために水面の上に残っていることを確認します。細胞がほぼ解凍されると、通常約2分かかりますが、バイアルを組織培養フードに移動させます。

次に、キャップを取り外す前に、70%のエタノールでバイアルの外側を拭きます。滅菌ピペットを使用して、完全なRPMI培地の10ミリリットルを含む円錐形のチューブに細胞を移します。次に、1200 RPMでチューブを5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブをティッシュフードに戻し、エタノールでチューブの外側を拭きます。ペレットを邪魔することなく、上清を廃棄し、新鮮な完全なRPMI培地の5ミリリットルを追加し、ゆっくりと上下にピペットを再懸濁します。次に、細胞をT75細胞培養フラスコに移し、フラスコを5%の二酸化炭素インキュベーターの中に37°Cで入します。細胞が約80%の合流に達することを可能にし、通常は約3日かかります。ハイブリドーマ細胞は非付着性であり、培地中に懸濁して成長する。十分な合流に達するまでの時間は、生細胞の開始数および使用されるハイブリドーマ細胞のタイプに基づいて変化しうる。

細胞が十分に結合したら、無菌の25ミリリットルのピペットを使用して、培養フラスコから円錐遠心管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離により細胞をペレットする。細胞が遠心分離機にある間、3つの新しいT75細胞培養フラスコのそれぞれに完全なRPMIの18ミリリットルを加え、これらを脇に置きます。遠心分離後、上清を取り出し、完全なRPMIの6ミリリットルで細胞ペレットを穏やかに再中断します。次に、3つの新しい細胞培養フラスコのそれぞれに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。最後に、フラスコを5%の二酸化炭素と37°Cに設定したインキュベーターに入れ、フラスコが約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(約3日間)。

この時点で、細胞は、HB101サプリメントを含有する市販のHB基底液体培地などのハイブリドーマ細胞株用に設計された無血清培地中で成長を継続する準備ができている。各細胞培養フラスコから円錐遠心管に細胞を移し、1200 RPMで遠心分離によって細胞を5分間ペレットします。さて、6つの225センチメートル平方細胞培養フラスコのそれぞれに230ミリリットルの補充されたHB101無血清培地を追加し、それらを脇に置きます。遠心分離が完了したら、上清を取り除き、補充されたHB101培地の10ミリリットルで各ペレットを再中断する。次に、各細胞培養フラスコに、細胞懸濁液の5ミリリットルを添加する。フラスコを5%の二酸化炭素インキュベーターに37°Cに入れ、約3週間細胞の成長を続けます。この間、細胞は目的とするモノクローナル抗体を培養培地に産生して放出し、細胞が死に始めると抗体は精製の準備が整います。

抗体含有培養培養培養剤から細胞破片を除去するには、培養フラスコの内容物を固定角度ローター用のチューブに注ぎます。チューブをローターに入れ、遠心分離の前に適切にバランスを取っていることを確認します。チューブを 10,000 RPM で 8 分間回転させます。サンプルが遠心分離している間、アイスバケツに攪拌棒を持つ2リットルのプラスチックビーカーを置き、その後、攪拌プレートにアイスバケツを置きます。

次に、500ミリリットルのフィルタートップを1リットルのボトルに取り付けます。適切なチューブを使用して、このボトルトップフィルターユニットを家の真空に取り付けます。次いで、抗体を含む上清をフィルタートップに注ぐ。残りの培電分を遠心分離して、細胞破片を抗体含有上清から分離する。フィルタートップが上清でいっぱいになったら、真空を始めます。その後、1リットルの回収ボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、濾過した上清を氷の上2リットルビーカーに注ぎます。すべての上清が処理されるまでろ過手順を繰り返します。

すべてのサンプルが処理されると、濾過された上清の1リットル当たり295グラムの硫酸アンモニウムの重量を量る。攪拌プレートを開始し、ゆっくりと次の数時間にわたって上清に硫酸アンモニウムを追加します。これは、望ましくないタンパク質が沈殿する可能性のある硫酸アンモニウム塩の局所的な高濃度を防ぎます。硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートと一緒に4°Cの冷たい部屋に移動し、抗体溶液を一晩かき混ぜるように設定します。

翌朝、2リットルビーカーから硫酸アンモニウム含有抗体溶液を固定角ローター用のクリーンチューブに注ぎます。チューブを6500 RPMで20分間遠心分離し、チューブの底部に抗体をペレットする。次に、真空は上清を吸引し、柔らかいペレットを吸引しないように注意を用く。同じチューブセットを使用して、硫酸アンモニウム含有上清の残りの部分からペレット抗体を回収し続けます。最後の吸引後、PBSの約1ミリリットルで各抗体ペレットを再中断する。

抗体溶液から硫酸アンモニウムを除去するには、まず抗体溶液の各ミリリットルに対して約1インチの透析チューブを切断する。次に、蒸留水でチューブを拭き、チューブの一方の端に結び目を結び付します。チューブに蒸留水を充填し、結び目からの漏れを確認します。数分後に漏れがない場合は、チューブから水を空にします。

次に、抗体溶液をチューブにピペットする。可能な限り多くの抗体を回収するには、PBSの追加の0.25ミリリットルでチューブをすすぎ、チューブにも転送します。透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。次に、チューブの上部を4リットルビーカーの外側の上部にテープで留め、チューブの充填部分をビーカーにぶら下がします。さて、ビーカーを摂氏4度の冷たい部屋に持って行き、かき混ぜる皿の上に置きます。PBSでビーカーを上部に充填し、攪拌バーを追加します。チューブと溶液を約8時間一晩かき混ぜます。翌朝、ビーカーのPBSを新鮮なPBSに交換し、ビーカーを残して約8時間再びかき混ぜます。その晩、最後の1回を繰り返します。午前中に透析チューブを開き、チューブから15ミリリットルの円錐管に抗体溶液を移します。透析中に形成された可能性のある沈殿物を除去するには、1200 RPMでチューブを5分間遠心分離します。最後に、上清を新鮮なチューブに移します。

抗体濃度を定量するために、まず抗体アリコートから95マイクロリットルのPBSに5マイクロリットルを添加して20倍希釈を行う。次に、希釈した抗体をキュベットにピペットし、分光光度計を使用して280ナノメートルの濃度を記録します。次に、示した式を用いて抗体濃度を算出する。最後に、抗体名、濃度、調製日、および該当する場合は、バッチ番号および実験者名を有するラベルスクリューキャップバイアルを、次いで標識されたスクリューキャップバイアルに抗体をアリコートする。これらは必要になるまでマイナス80度で貯えることができる。

例えば、120G8アンチマウスCD317またはPDCA-1ハイブリドーマラインを用いた収量は44~99.6ミリグラムで、通常は平均67.3ミリグラムの量が得られます。同じハイブリドーマ細胞株を用いた各産生実行は、最後に利用可能なモノクローナル抗体の量においてわずかに異なる可能性があることに注意することが重要である。

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