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Immunfluoreszenzmikroskopie: Immunfluoreszenzfärbung paraffin-embedded Tissue Sections

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Die Funktion eines Proteins in einer Zelle hängt weitgehend von seiner richtigen Lokalisierung innerhalb der Zelle ab. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine Methode, mit der ein Protein in Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert werden kann. Ein Fluoreszenzfarbstoff ist ein Fluorophor, d. h. ein Molekül, das Lichtenergie bei einer bestimmten Wellenlänge durch einen Prozess namens Anregung absorbiert und dann sofort die Energie bei einer anderen Wellenlänge, der sogenannten Emission, abgibt.

Fluoreszierende Farbstoffe werden zu einem zielspezifischen Antikörper konjugiert und durch Immunfärbung in kultivierte Zellen oder Gewebe eingeführt. Wenn dieser primäre Antikörper an das Protein von Interesse bindet, wird das Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet. Alternativ kann der Fluoreszenzfarbstoff anstelle des primären Antikörpers zu einem sekundären Antikörper konjugiert werden, und der sekundäre Antikörper bindet an den Protein-Primärantikörperkomplex, um das Ziel zu kennzeichnen. Danach wird die Probe in einem Antifade-Montagemedium versiegelt, um die Fluoreszenz-Etikettierung zu erhalten, und ist dann bereit für die Bildgebung auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Ein Fluoreszenzmikroskop ist mit einer leistungsstarken Lichtquelle ausgestattet. Der Lichtstrahl durchläuft zunächst einen Anregungsfilter, der nur das Licht an der Anregungswellenlänge passieren lässt. Das Anregungslicht erreicht dann einen speziellen Spiegel, einen sogenannten dichroitischen Spiegel oder einen Strahlsplitter, der die Anregungswellenlänge selektiv in Richtung einer Objektivlinse reflektiert. Die Linse fokussiert das Licht dann auf einen kleinen Bereich in der Probe. Beim Erreichen der Probe erregt das Licht die Fluorophore, die dann die Lichtenergie bei einer anderen Wellenlänge abgeben. Dieses Licht wird durch die Objektivlinse zurück zum dichroitischen Spiegel übertragen. Da sich die Emissionswellenlänge von der Anregungswellenlänge unterscheidet, lässt der dichroitische Spiegel das Emissionslicht passieren. Dann geht es durch einen zweiten Filter, den sogenannten Emissionsfilter, der Licht von allen anderen Wellenlängen eliminiert, die vorhanden sein können. Danach erreichen die Lichtstrahlen nun das Okular oder die Kamera, wo sie ein vergrößertes Bild präsentieren, das aus dem emittierten Licht aus den spezifischen Fluorophoren erzeugt wird. Dieses Bild stellt die Position des Proteins dar, das in der Zelle von Interesse ist.

DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zusammen mit Immunostainierung verwendet, um Kerne als Bezugspunkt innerhalb der Zellen zu kennzeichnen. Mehrere verschiedene Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungsemissionswellenlängen können für verschiedene Proteine innerhalb derselben Probe verwendet werden, um die Lokalisation der Proteine zu vergleichen.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur immunfluoreszenten Färbung eines Proteins von Interesse in einer Gewebeprobe, gefolgt von der Abbildung der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Bevor der Färbevorgang begonnen wird, müssen die Abschnitte, die während des Einbettungsprozesses dehydriert wurden, rehydriert werden. Um dies zu tun, legen Sie zuerst die Dias in einen Diahalter und tauchen Sie dann die Dias vollständig in 100% Xlene-Isomer ein. Lassen Sie die Folien drei Minuten lang inkubieren. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie überschüssiges Xylol mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einen frischen Behälter, für weitere drei Minuten. Wiederholen Sie diese Inkubation jedes Mal in einem neuen Behälter mit frischem Xylol und wischen Sie die Dias mit Papiertüchern ab, bevor Sie in den neuen Behälter überführen, für insgesamt drei Inkubationen. Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für zwei Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere zwei Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Wischen überschüssiges Ethanol mit einem Papiertuch, und die Übertragung der Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Konzentrationen von Ethanol für die angegebene Zeit. Nach dem letzten Ethanolwaschen die überschüssige Lösung abschütteln und die Dias in 1X PBS für fünf Minuten inkubieren.

Um den Färbungsprozess zu beginnen, kreisen Sie zunächst die Abschnitte mit einem PAP-Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den die Puffer abdecken müssen. Sobald die Abschnitte auf der Folie deutlich markiert sind, fügen Sie jedem Dia 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Abschnittsoberfläche abgedeckt ist. Nachdem die Gewebe mit einem Sperrpuffer bedeckt sind, legen Sie die Dias in eine befeuchtete Kammer. Lassen Sie die Dias für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie den Sperrpuffer nach der gewünschten Inkubationszeit, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Verdünnen Sie als Nächstes den primären Antikörper im Blockierpuffer. Für eine Verdünnung von 1:100 990 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen, gefolgt von 10 Mikrolitern des primären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Beschriften Sie eine Folie als Steuerelement, und fügen Sie dann 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu. Diese Kontrolle wird dazu beitragen, eine nicht spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu identifizieren. Fügen Sie nun 100 Mikroliter primärer Antikörperpuffer zu den verbleibenden Folien hinzu. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius, im Dunkeln.

Entfernen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Abschnitte aus der Kammer und entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und den Blockierpuffer von der Steuerung. Legen Sie die Dias in ein Schieberegal und waschen Sie sie dann dreimal in 1X PBS für jeweils zehn Minuten. Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper im Sperrpuffer. Für eine Verdünnung von 1:200 995 Mikroliter Sperrpuffer zu einem 1,5 Milliliter-Rohr hinzufügen, gefolgt von fünf Mikrolitern des sekundären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten, einschließlich der Steuerung, hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie die Folien aus dem Inkubator. Entleeren Sie den sekundären Antikörper von den Abschnitten. Sobald der sekundäre Antikörper entfernt wurde, legen Sie die Dias in ein Dia-Rack und tauchen Sie die Dias dann für 10 Minuten vollständig in 1X PBS ein, geschützt vor Licht. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal, mit frischen 1X PBS für jede Wäsche. Fügen Sie nach dem Einwaschzwei bis drei Tropfen Montagemedien, die DAPI enthalten, zu jedem Dia hinzu und legen Sie einen Glasdeckel auf die Proben. Lassen Sie die Dias über Nacht an einem dunklen Ort trocknen, bevor Sie die Abschnitte mit einem fluoreszierenden Bereich bebildern.

Während der Bildgebung hängen die Details der Bildaufnahme vom jeweiligen Mikroskop und der verfügbaren Software ab. In diesem speziellen Beispiel jedoch die Software Leica Application Suite, Version 3. 8, wird verwendet, um die Analyse durchzuführen. Klicken Sie mit diesem Programm auf die Registerkarte "Erwerben" und aktivieren Sie im Modus Bild-Overlay-Erfassung sowohl DAPI als auch RFP. Passen Sie als Nächstes belichtung, Gain und Gamma für DAPI und RFP an, indem Sie eine Initiale mit den von der Software definierten Standardeinstellungen vornehmen und dann die Helligkeit optimieren, indem Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung ändern, wobei zu berücksichtigen ist, dass minimale optimale Einstellungen bildsättigung und Photobleichung der Proben zu vermeiden. Gamma kann geändert werden, um dunklere Bereiche eines Bildes zu optimieren.

Sobald die Einstellungen angepasst wurden, drücken Sie die Schaltfläche Overlay erfassen, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen. Dieses Mit der demonstrierten Technik aufgenommene Beispielbild zeigt einen Maus-Brusttumorabschnitt, der mit dem Antikörper F4/80 befleckt ist und ein rot dargestelltes Antigen auf Makrophagen und anderen myeloischen Zellen erkennt. Da DAPI-haltige Montagemedien verwendet wurden, werden Kerne blau dargestellt. Die Daten aus der Bildgebung liefern Informationen über die Intensität und Lokalisierung des Proteins innerhalb des Gewebeabschnitts.

Im Bild des mit F4/80 gebeizten Tumors wird beispielsweise die Zelloberflächenfärbung dieses Antigens beobachtet. Diese Daten können auch Informationen über die Häufigkeit bestimmter Zellpopulationen innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Dies kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen, hier rot dargestellt, gezählt und mit der gesamten Zellpopulation verglichen wird, die blau dargestellt ist, und die Häufigkeit mit der folgenden Gleichung berechnet.

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