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免疫蛍光顕微鏡:パラフィン埋め込組織切片の免疫蛍光染色

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細胞内のタンパク質の機能は、細胞内の適切な局在化に大きく依存します。免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素を用いて細胞内でタンパク質を可視化する方法である。蛍光色素は、励起と呼ばれるプロセスによって特定の波長で光エネルギーを吸収し、発光と呼ばれる異なる波長ですぐにエネルギーを放出する分子である蛍光色素です。

蛍光色素は、標的特異的抗体に結合し、免疫染色によって培養細胞または組織に導入される。この一次抗体が目的のタンパク質に結合すると、タンパク質は蛍光色素で標識されます。あるいは、蛍光色素は、一次抗体の代わりに二次抗体に共役することができ、二次抗体は、標的を標識するタンパク質一次抗体複合体に結合する。その後、サンプルは蛍光標識を保持するためにアンチフェード取り付け媒体で密封され、蛍光顕微鏡でイメージングする準備が整います。

蛍光顕微鏡には強力な光源が装備されています。光線は最初に励起フィルタを通過し、励起波長の光のみが通過します。励起光は、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッタと呼ばれる特殊なミラーに到達し、対物レンズに向かって励起波長を選択的に反射するように設計されています。レンズは、サンプル内の小さな領域に光を焦点を当てます。サンプルに到達すると、光は蛍光素を励起し、異なる波長で光エネルギーを放出します。この光は、対物レンズを通してダイクロイックミラーに送り返されます。発光波長は励起波長と異なるので、ダイクロイックミラーは発光光を通過することができます。次に、発光フィルタと呼ばれる2番目のフィルタを通過し、存在する可能性のある他の波長から光を除去します。その後、光線はアイピースまたはカメラに到達し、特定の蛍光体から放出された光から作成された拡大画像を提示します。この画像は、細胞内の目的タンパク質の位置を表す。

DNA結合蛍光色素は、細胞内の基準点として核を標識する免疫染色と共にしばしば使用される。異なる励起放出波長を持つ複数の異なる蛍光色素は、同じサンプル内の異なるタンパク質に使用して、タンパク質の局在化を比較することができます。

このビデオは、組織サンプル中の目的のタンパク質の免疫蛍光染色の手順を示し、その後、蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングする。

染色プロセスを開始する前に、埋め込みプロセス中に脱水されたセクションは、水分補給する必要があります。これを行うには、まずスライドをスライドホルダーに入れ、次に100%Xlene異体素でスライドを完全に水没させます。スライドが 3 分間インキュベートできるようにします。その後、容器からスライドを取り出し、ペーパータオルで余分なキシレンを拭き取り、さらに3分間、新鮮な容器に新しいキシレン浴に入れます。新鮮なキシレンを入れた新しい容器でこのインキュベーションを毎回繰り返し、ペーパータオルでスライドを拭き取ってから、新しい容器に移す前に、合計3回のインキュベーションを行います。次に、100%エタノールから2分間、一連の等級付きエタノール溶液でセクションをインキュベートします。スライドラックをペーパータオルで拭き取り、スライドを100%エタノールの新しい容器に移し、さらに2分間使用します。ペーパータオルで余分なエタノールを拭き取り、指定された時間のエタノールの指定濃度に従って、新しい浴場にスライドを移す洗浄のサイクルを続けます。最終的なエタノール洗浄の後、余分な溶液を振り落とし、5分間1X PBSでスライドをインキュベートします。

染色プロセスを開始するには、まず、PAP ペンでセクションを丸で囲み、バッファーがカバーする必要がある最小領域を識別します。スライド上のセクションが明確にマークされたら、各スライドに100マイクロリットルのブロッキングバッファを追加し、セクション表面全体をカバーするようにします。組織がブロッキングバッファーで覆われた後、加湿室にスライドを置きます。スライドをそのままにして室温で1時間インキュベートします。

目的のインキュベーション時間に従って、スライドから排出してブロッキングバッファを取り除きます。次に、ブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈する。1:100希釈の場合、1.5ミリリットルの遠心管に990マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、続いて10マイクロリットルの一次抗体を同じチューブに追加します。1つのスライドにコントロールとしてラベルを付け、100マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。この対照は、二次抗体の任意の非特異的結合を同定するのに役立つ。次に、残りのスライドに100マイクロリットルの一次抗体バッファーを追加します。暗闇の中で、4度の摂氏で加湿室で一晩セクションをインキュベートします。

一晩インキュベーションに続いて、チャンバから切片を取り出し、各スライドおよびブロッキングバッファーから一次抗体を排出する。スライドをスライドラックに入れ、1X PBSでそれぞれ10分間3回洗います。スライドが1X PBSで洗浄している間、ブロッキングバッファーで二次抗体を希釈する。1:200希釈の場合、1.5ミリリットルチューブに995マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、続いて同じチューブに2次抗体の5マイクロリットルを追加します。コントロールを含むすべてのセクションに二次抗体を追加し、光から保護された加湿室で1時間インキュベートします。タイマーが鳴ったら、インキュベーターからスライドを取り外します。二次抗体を切り離します。二次抗体を取り除いたら、スライドをスライドラックに入れ、スライドを1X PBSで10分間完全に水没させ、光から保護します。この洗浄を3回繰り返し、各洗浄に新鮮な1X PBSを使用します。洗い流しの後、各スライドにDAPIを含む取り付けメディアを2~3滴追加し、サンプルにガラスカバースリップを配置します。蛍光スコープを使用してセクションをイメージングする前に、スライドを暗い場所で一晩乾燥させます。

イメージング中、画像キャプチャの詳細は、利用可能な特定の顕微鏡とソフトウェアに依存します。ただし、この特定の例では、ソフトウェアライカアプリケーションスイート、バージョン3。8は、分析を行うために使用される。このプログラムを使用して、[取得]タブとイメージオーバーレイ集録モードをクリックして、DAPIとRFPの両方を有効にします。次に、DAPI と RFP の両方の露出、ゲイン、およびガンマを調整し、ソフトウェアで定義された既定の設定を使用して初期設定を行い、露出時間とゲインを変更して明るさを最適化します。サンプルの画像飽和および光漂白を避けるために望ましい。ガンマは、画像の暗い領域を最適化するために変更できます。

設定を調整したら、[オーバーレイの取得] ボタンを押して、DAPI と RFP 露出のオーバーレイ イメージを作成します。この例画像は、実証された技術を用いて捕捉され、マウス乳腺腫瘍セクションを示し、抗原を検出する抗体F4/80で染色され、マクロファージおよび他の骨髄細胞上に赤色で描かれた。DAPI含有実装媒体を用いたので、核は青色で示される。イメージングからのデータは、組織セクション内のタンパク質の強度と局在化に関する情報を提供します。

例えば、F4/80で染色された腫瘍の画像では、この抗原の細胞表面染色が観察される。これらのデータはまた、組織セクション内の特定の細胞集団の頻度に関する情報を提供することができる。これは、正に染色された細胞の数を数え、ここでは赤色で示し、それを総細胞集団と比較し、青色で示し、以下の式を用いて周波数を計算することによって定量することができる。

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