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共聚焦荧光显微镜:确定小鼠纤维细胞中蛋白质定位的技术
 

共聚焦荧光显微镜:确定小鼠纤维细胞中蛋白质定位的技术

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共聚焦荧光显微镜是一种专门的成像技术,通过用抗体结合的荧光染料标记抗原并检测荧光信号,在细胞或组织样本中定位感兴趣的蛋白质或抗原。与广场荧光显微镜相比,它提供了更高的空间分辨率,在物镜焦平面上放置了两个针孔,使其得名共聚焦。它使用户能够在亚细胞水平上可视化染色,例如表面膜染色与细胞内染色之间的区分。

共聚焦显微镜遵循与经典荧光显微镜类似的基本原理。光源的光束(通常是用于共聚焦的激光)由二色镜反射,并由样品上的物镜聚焦。这种光激发荧光道发出不同的波长,通过物镜和二色镜传回相机或目镜。

共聚焦显微镜的分辨率增强主要是由于存在两个针孔,这是非常小的孔,供光线在激发和发射光路径上通过。针孔战略性地放置在物镜的焦点平面上。现在,让我们切换到显微镜排列的侧视图示意图,以检查光路径。穿过激励针孔后,激发光束具有源自焦点的效果,从而使物镜能够将光线聚焦到样品上的一个点上。来自该焦点的发射光束收敛在发射针孔处,从而允许其通过。现在在激发过程中,光道内外的荧光道,在焦点上方和下方,也稍微兴奋。当来自焦点的发射光穿过针孔时,来自离焦点的发射点在发射针孔之前或之后会汇聚,因此被阻塞,从而导致背景荧光减少。

激发-发射-检测周期需要针对目标区域中的每个成像点重复,这可以通过几种不同的方式完成。例如,激光扫描共聚焦使用电流计扫描镜,从而在不同角度偏转激发光。因此,在 XY 平面上将光束扫过试样。旋转光盘共聚焦使用具有针孔阵列的光盘,该光盘旋转以移动针孔的排列。这使用户能够每次照亮样品中的多个小成像点,随着光盘旋转,逐渐覆盖整个区域。由于针孔,探测器上的 XY 图像表示一个狭窄的 Z 平面。因此,可以从一系列连续的 Z 平面(通常称为 Z 堆栈)中收集图像。从这些图像中,适当的软件可以生成样品中荧光信号模式的 3D 描述。

在此协议中,您将观察小鼠成纤维细胞的免疫染色,随后在共聚焦显微镜上进行成像,以差异地可视化细胞表面蛋白和流解体蛋白。

首先,使用无菌技术,将感兴趣的细胞重新悬浮在每口井500微升的生长介质中,然后将它们播种到四井室滑动的井中。在这里,我们使用被转染的小鼠成纤维细胞来表达抗原呈现分子CD1d。为了让细胞粘附在玻璃上,将腔室滑动在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中,并在一夜之间孵育。早晨,从每个井中吸出介质,然后用500微升的PBS清洗细胞一次几秒钟。

要修复细胞,在每个井中加入500微升1%的甲醛溶液,并在室温下孵育15分钟。孵育后,将甲醛收集到适当的危险液体废物容器中,然后用PBS清洗细胞三次,以几秒钟清除任何固定物。

为了让抗体渗透到细胞中,在每个井中加入500微升的渗透缓冲液,并在室温下在工作台上孵育15分钟。渗透后,用500微升的PBS短暂地清洗细胞三次。接下来,在每个井中加入500微升的阻断缓冲液,并在4摄氏度下孵育一小时,以防止非特异性抗体结合。

以适当的工作浓度制备主要抗体,抗CD1d和抗LAMP-1。然后,从井中吸出缓冲液,用500微升稀释的原抗体溶液覆盖每个井中的细胞,然后在4摄氏度的平坦表面上孵育滑道过夜。第二天早上,稀释二级抗体,在这种情况下,一种具有明显荧光标记的抗鼠和抗鼠抗体,在阻断缓冲液中以适当的工作浓度。接下来,从井中吸出原抗体溶液,然后用500微升的PBS清洗细胞四次。然后,将500微升稀释的二级抗体溶液加入每口井中,在室温下在黑暗中孵育一小时。孵育后,吸出二级抗体溶液,用500微升的PBS清洗井4次,以去除任何未结合的二级抗体。

要在最终清洗后安装样品,请小心地从滑轨上拆下腔室。要移除残留的 PBS,请将幻灯片以一定角度握住精细的任务擦除,并在不接触单元格的情况下从边缘取出液体。一旦去除多余的PBS,在细胞的每个部分添加一滴含有核染色DAPI的抗褪色安装介质。接下来,采取20乘60毫米的盖玻片,并使用指尖开始缓慢降低覆盖滑片在任一边缘,注意避免气泡形成在细胞。用精细的任务擦拭擦拭幻灯片上任何额外的安装介质,并将幻灯片存放在室温下,在室内温度下存放长达一周。

要开始对单元格进行映像,请先单击桌面上的 NIS 软件图标。进入控制窗口后,单击顶部的 TiPad 选项卡,然后选择所需的成像目标。然后,将带有单元格的幻灯片加载到舞台上,并将其居于镜头下方。接下来,在 TiPad 选项卡旁边的 A1plus 紧凑型 GUI 选项卡上,设置适合使用的荧光荧光道的激光器。单击齿轮符号以打开染料和光谱设置菜单。染料和光谱设置菜单打开后,选择所需的通道并为每个通道设置激光。然后,在第一个二色镜下的下拉菜单中选择适当的排放。接下来,在 A1plus 紧凑型 GUI 窗口中,单击 Ch.Series 以设置线路通道系列,该系列设置所使用的激光器是同时或按顺序对样品开火。

之后,通过单击顶部的箭头提示图标开始扫描。此时,当成像是实时的时,在 A1plus 紧凑型 GUI 窗口下,单击滑动刻度,并修改针孔大小以确保限制失焦光线。接下来,使用滑动刻度将每台激光下的高压和偏移设置调整到适当的水平,以便检测特定的染色,同时限制任何潜在的背景染色。如果有正的染色样品,首先为每个通道对样品进行成像,以确保激光设置产生最佳的信噪比。设置每个激光器的最佳 HV 和偏移值后,单击 ND 采集选项卡,然后选择 Z 图标以设置 z 系列的参数。

接下来,在获取示例的实时图像时,首先通过查找图像底部并单击底部按钮来设置底部。然后,找到示例的顶部位置,然后单击顶部按钮。通过为每个步骤专门键入首选步长(以微米)或指定所需的总步长数来设置步长大小。要选择图像所需的大小/像素分辨率,请单击 Aiplus 紧凑型 GUI 窗口,并在大小图标下选择所需的分辨率。

要降低图像的噪点,可以选择 ta 符号旁边的下拉菜单,以平均所选图像数。在此之后,单击 ND 采集菜单上的"立即运行"选项卡以开始映像示例。映像完成后,通过单击文件保存图像,然后保存为 ,这将导出带有扩展名点 2 的图像文件。最后,对每个其他示例重复此过程。

在这个实验中,表达表面糖蛋白基因CD1d的小鼠成纤维细胞被固定、免疫染色,并在共聚焦显微镜上成像。此图像以 40 倍的放大倍率显示 Z 堆栈的单个部分,其中 CD1d 被染成红色。样品与LAMP-1(一种水球体标记物)一起以绿色标记。核染色DAPI用于显示细胞核。

在合并三个不同通道的复合图像中,黄色的外观产生于红色和绿色通道的重叠,并指示 CD1d 和 LAMP-1 在等体中共同本地化的区域。只有一种颜色的区域表示存在 CD1d 或 LAMP-1,但没有共同本地化。此图像显示从 z 堆栈中捕获的图像构建的单元格的 3D 渲染,此方法启用了此单元格组的侧视图构造。下图以 100 倍放大倍数从 z 堆栈中分出一个切片,更详细地演示了这两种蛋白质的表达模式。图像右侧的粉红色轮廓框显示图像中粉红色线指定的 x 坐标的横截面,该线表示粉红色线条的侧视图。同样,图像底部的蓝色轮廓框显示图像中由蓝线指定的 y 坐标的横截面,该横线表示蓝线处的前视图。z 堆栈图像的 3D 渲染使用户能够以 3D 形式查看图像,并可视化所有 x、y 和 z 平面。这可以用来研究细胞内不同区域不同污渍的共同定位。

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