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Konfokale Fluoreszenzmikroskopie: Eine Technik zur Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Fibroblasten

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Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezialisierte bildgebende Technik zur Lokalisierung eines Proteins oder Antigens von Interesse in einer Zell- oder Gewebeprobe, indem das Antigen mit einem antikörperkonjugierten Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet und das fluoreszierende Signal erkannt wird. Es bietet eine höhere räumliche Auflösung als weiträumige Fluoreszenzmikroskopie, mit Hilfe von zwei Lochlöchern, die an den Brennebenen der Objektivlinse platziert werden, was ihm den Namen konfokale gibt. Es ermöglicht Benutzern, die Färbung auf subzellulärer Ebene zu visualisieren, wie die Unterscheidung zwischen Oberflächenmembranfärbung von intrazellulärer Färbung.

Ein konfokales Mikroskop folgt einem ähnlichen Grundprinzip wie ein klassisches Fluoreszenzmikroskop. Der Strahl einer Lichtquelle, in der Regel ein Laser für konfokale, wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert und durch eine Objektivlinse auf die Probe fokussiert. Dieses Licht regt die Fluorophore zu einer anderen Wellenlänge an, die durch die Objektivlinse und den dichroitischen Spiegel zu einer Kamera oder einem Okular zurückfließt.

Die verbesserte Auflösung eines konfokalen Mikroskops ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von zwei Lochlöchern zurückzuführen, bei denen es sich um sehr kleine Löcher handelt, die Licht auf den Anregungs- und Emissionslichtpfaden passieren kann. Die Lochlöcher werden strategisch auf der Brennebene der Objektivlinse platziert. Wechseln wir nun zu einem Seitenansichtsschema der Mikroskopanordnung, um den Lichtpfad zu überprüfen. Nach dem Durchlaufen des Anregungslochs hat der Anregungslichtstrahl den Effekt, dass er von einem Brennpunkt ausgeht, was es der Objektivlinse ermöglicht, das Licht dann auch auf einen Punkt auf die Probe zu fokussieren. Der Emissionsstrahl von diesem Brennpunkt konvergiert am Emissionsloch, wodurch er passieren kann. Während der Anregung sind die Fluorophore innerhalb des Lichtweges oberhalb und unterhalb des Brennpunkts auch leicht aufgeregt. Während das vom Brennpunkt ausgehende Emissionslicht durch das Loch geht, konvergieren die Emissionen der out-of-fokus-Punkte vor oder nach dem Emissionsloch und werden daher blockiert, was zu einer reduzierten Hintergrundfluoreszenz führt.

Der Anregungs-Emissions-Erkennungszyklus muss für jeden Bildpunkt im Interessenbereich wiederholt werden, was auf verschiedene Weise erfolgen kann. Beispielsweise verwendet das Laserscanning confocal galvanometer-Scanning-Spiegel, die das Anregungslicht in verschiedenen Winkeln ablenken. Daher den Lichtstrahl über die Probe in der XY-Ebene zu fegen. Spinning Disc konfokale verwendet eine Scheibe mit einer Reihe von Lochlöchern, die sich dreht, um die Anordnung der Pinholes zu verschieben. Auf diese Weise können Benutzer jedes Mal mehrere kleine Bildstellen in der Probe beleuchten und nach und nach den gesamten Bereich abdecken, während sich die Scheibe dreht. Durch die Lochlöcher stellt das XY-Bild am Detektor eine schmale Z-Ebene dar. Daher können Bilder aus einer Reihe aufeinander folgender Z-Ebenen gesammelt werden, die oft als Z-Stack bezeichnet werden. Aus diesen Bildern kann eine entsprechende Software eine 3D-Darstellung des Fluoreszenzsignalmusters in der Probe erzeugen.

In diesem Protokoll beobachten Sie die Immunostainierung von Maus-Fibroblasten, gefolgt von einer Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop, um ein Zelloberflächenprotein und ein lysosomales Protein differenziell zu visualisieren.

Um mit sterilen Techniken zu beginnen, die Zellen von Interesse in 500 Mikroliter Wachstumsmedien pro Brunnen wieder auszusetzen, und sie dann in die Brunnen einer Vier-Brunnen-Kammerrutsche säen. Hier verwenden wir Maus-Fibroblasten, die transfiziert wurden, um das antigenpräsentierende Molekül CD1d auszudrücken. Damit die Zellen am Glas haften können, schieben Sie die Kammer in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie über Nacht. Am Morgen, aspirieren Sie die Medien aus jedem Brunnen, und dann waschen Sie die Zellen einmal mit 500 Mikroliter PBS für ein paar Sekunden.

Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 500 Mikroliter 1% Paraformaldehydlösung in jeden Brunnen ein und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation das Paraformaldehyd in einen geeigneten Behälter für gefährliche Flüssigkeiten sammeln und dann alle Reste des Fixativs entfernen, indem Sie die Zellen dreimal mit PBS für ein paar Sekunden waschen.

Um das Eindringen von Antikörpern in die Zellen zu ermöglichen, fügen Sie jedem Bohrkörper 500 Mikroliter Permeabilisationspuffer hinzu und brüten sie 15 Minuten bei Raumtemperatur auf der Bank. Nach der Permeabilisation die Zellen mit 500 Mikroliter PBS kurz waschen. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen hinzu und brüten für eine Stunde bei vier Grad Celsius, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Bereiten Sie die primären Antikörper, Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, in entsprechenden Arbeitskonzentrationen vor. Dann den Puffer aus den Brunnen ansaugen und die Zellen in jedem Brunnen mit 500 Mikrolitern verdünnter Primärantikörperlösung bedecken und dann den Schlitten über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer ebenen Oberfläche bebrüten. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die sekundären Antikörper, in diesem Fall einen Anti-Maus- und Rattenanti-Antikörper mit deutlichen Fluoreszenz-Tags, im Blockierpuffer zu entsprechenden Arbeitskonzentrationen. Als nächstes die primäre Antikörperlösung aus den Brunnen aspirieren und dann die Zellen viermal mit 500 Mikroliter PBS waschen. Dann 500 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörperlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung ansaugen und die Brunnen viermal mit 500 MikroliterPBS waschen, um alle ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.

Um die Proben nach der letzten Wäsche zu montieren, lösen Sie die Kammern vorsichtig und entfernen Sie sie von der Rutsche. Um die verbleibende PBS zu entfernen, halten Sie die Folie in einem Winkel über einem empfindlichen Aufgabenwisch, und entfernen Sie die Flüssigkeit von den Rändern, ohne die Zellen zu berühren. Sobald die überschüssige PBS entfernt wurde, fügen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium, das den kerntechnischen Fleck DAPI enthält, auf jeden Zellabschnitt ein. Nehmen Sie als Nächstes einen 20 mal 60-Millimeter-Abdeckungsslip, und mit nur Fingerspitzen beginnen Sie, den Coverslip langsam auf beiden Kanten zu senken, wobei darauf zu achten ist, dass Blasenbildung über den Zellen vermieden wird. Wischen Sie jedes zusätzliche Montagemedium auf den Dias mit einem zarten Aufgabenwisch ab und lagern Sie die Dias bei Raumtemperatur bis zu einer Woche im Dunkeln.

Um mit der Abbildung der Zellen zu beginnen, klicken Sie zuerst auf das NIS-Softwaresymbol auf dem Desktop. Sobald Sie im Kontrollfenster sind, klicken Sie oben auf die Registerkarte TiPad, und wählen Sie das gewünschte Ziel für die Bildgebung aus. Laden Sie dann den Dia mit Zellen auf die Bühne und zentrieren Sie ihn unter der Linse. Als nächstes richten Sie auf der Registerkarte A1plus Compact GUI neben dem TiPad-Tab die Fürdier verwendeten Laser ein. Klicken Sie auf das Zahnradsymbol, um das Menü Farb- und Spektraleinstellungen zu öffnen. Sobald das Menü farb- und spektrale Einstellungen geöffnet ist, wählen Sie die benötigten Kanäle aus und stellen Sie den Laser für jeden Kanal ein. Wählen Sie dann die entsprechenden Emissionen im Dropdown-Menü unter dem ersten dichroitischen Spiegel aus. Klicken Sie anschließend unter dem A1plus Compact GUI-Fenster auf Ch.Series, um die Linienkanalserie einzurichten, die festlegt, ob die verwendeten Laser gleichzeitig oder sequenziell auf die Probe feuern.

Danach beginnen Sie mit dem Scannen, indem Sie oben auf das Pfeilspitzensymbol klicken. An dieser Stelle, während die Bildgebung live ist, klicken Sie unter dem A1plus Compact GUI-Fenster auf die Schiebeskala, und ändern Sie die Lochgröße, um die Begrenzung von Nichtfokuslicht zu gewährleisten. Passen Sie als Nächstes die Hochspannungs- und Offseteinstellungen unter jedem Laser auf entsprechende Ebenen an, indem Sie die Gleitwaagen verwenden, um die Erkennung der spezifischen Färbung zu ermöglichen und gleichzeitig mögliche Hintergrundfärbungen einzuschränken. Wenn eine positive Färbeprobe verfügbar ist, beginnen Sie mit der Abbildung dieser Probe für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass die Lasereinstellungen optimale Signal-Rausch-Verhältnisse ergeben. Nachdem Sie die optimalen HV- und Offsetwerte für jeden Laser eingestellt haben, klicken Sie auf die Registerkarte ND-Erfassung, und wählen Sie dann das Z-Symbol aus, um die Parameter für die Z-Serie einzurichten.

Wenn Sie als Nächstes ein Livebild des Beispiels abrufen, legen Sie zuerst den unteren Bereich des Bildes fest, indem Sie den unteren Rand des Bildes finden und auf die untere Schaltfläche klicken. Suchen Sie dann die obere Position des Beispiels und klicken Sie auf die obere Schaltfläche. Legen Sie die Schrittgröße fest, indem Sie die bevorzugte Schrittgröße für jeden Schritt in Mikrometer eingeben oder angeben, wie viele Schritte insgesamt erforderlich sind. Um die gewünschte Größe/Pixelauflösung des Bildes auszuwählen, klicken Sie auf das Aiplus Compact GUI-Fenster, und wählen Sie unter dem Größensymbol die gewünschte Auflösung aus.

Um das Rauschen des Bildes zu verringern, können Sie das Dropdown-Menü neben dem Theta-Symbol auswählen, um die ausgewählte Anzahl von Bildern zu durchschnittlich zu haben. Klicken Sie anschließend im Menü ND-Erfassung auf die Registerkarte Jetzt ausführen, um mit der Bildgebung des Beispiels zu beginnen. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild, indem Sie auf Datei klicken, und speichern Sie dann unter, wodurch die Bilddatei mit der Erweiterung dot-nd2 exportiert wird. Wiederholen Sie schließlich den Vorgang für jede der anderen Stichproben.

In diesem Experiment wurden Maus-Fibroblasten, die das Oberflächenglykoprotein-Gen CD1d exzessierten, fixiert, immungefärbt und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Dieses Bild zeigt einen einzelnen Abschnitt eines Z-Stacks bei 40-facher Vergrößerung, wobei CD1d rot gefärbt ist. Die Probe wurde mit LAMP-1, einem lysosomalen Marker, in Grün gecostainiert. Kernfleck DAPI wurde verwendet, um die Kerne der Zellen zu zeigen.

In einem zusammengesetzten Bild, in dem die drei verschiedenen Kanäle zusammengeführt werden, ergibt sich das Auftreten von Gelb aus der Überlappung der roten und grünen Kanäle und zeigt einen Bereich an, in dem CD1d und LAMP-1 in den Lysosomen kolokalisiert sind. Bereiche, in denen nur eine Farbe vorhanden ist, zeigen das Vorhandensein von CD1d oder LAMP-1 ohne Kolokalisierung an. Dieses Bild zeigt eine 3D-Rendering der Zellen aus Bildern im Z-Stack aufgenommen erstellt und diese Methode ermöglichte die Konstruktion einer Seitenansicht dieser Gruppe von Zellen. Die folgende Abbildung zeigt ein Segment aus dem Z-Stack bei 100-facher Vergrößerung, das die Expressionsmuster dieser beiden Proteine genauer demonstriert. Das rosa umrissene Feld auf der rechten Seite des Bildes zeigt den Querschnitt der x-Koordinate an, die durch die rosa Linie im Bild gekennzeichnet ist, die die Seitenansicht an der rosa Linie darstellt. In ähnlicher Weise zeigt das blau umrissene Feld am unteren Rand des Bildes den Querschnitt der y-Koordinate, der durch die blaue Linie im Bild bezeichnet wird, die die Vorderansicht der blauen Linie darstellt. Das 3D-Rendering des Z-Stack-Bildes ermöglicht es Benutzern, das Bild in 3D anzuzeigen und alle x-, y- und z-Ebenen zu visualisieren. Dies kann verwendet werden, um die Kolokalisierung der verschiedenen Flecken an verschiedenen Regionen innerhalb der Zelle zu untersuchen.

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