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共焦点蛍光顕微鏡:マウス線維芽細胞におけるタンパク質の局在を決定する技術

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共焦点蛍光顕微鏡は、抗体共役蛍光色素で抗原を標識し、蛍光シグナルを検出することにより、細胞または組織サンプルに関心のあるタンパク質または抗原の局在化のための特殊なイメージング技術です。広視野蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を提供し、対物レンズの焦点面に配置された2つのピンホールの助けを借りて、その名前を共焦点に与えます。細胞内染色からの表面膜染色の分化など、細胞内レベルで染色を可視化できます。

共焦点顕微鏡は、古典的な蛍光顕微鏡と同様の基本原理に従います。光源からのビーム(通常は共焦点用レーザー)は、ダイクロイックミラーによって反射され、サンプル上の対物レンズによって焦点を当てます。この光は、カメラやアイピースに対して対物レンズとダイクロイックミラーを通って戻って移動する異なる波長を放出するために蛍光を励ます。

共焦点顕微鏡の高められた決断は主に励起および放出の光の道を通る光のための非常に小さい穴である2つのピンホールの存在によるものである。ピンホールは、対物レンズの焦点面に戦略的に配置されます。次に、顕微鏡配置の側面図回路図に切り替えて、光路を確認してみましょう。励起ピンホールを通過した後、励起光ビームは焦点から発信する効果を有し、対物レンズがサンプル上の点にも光を集中させます。この焦点からの放出ビームは、通過することを可能にする発光ピンホールに収束します。今、励起の間に、光経路内の蛍光体は、焦点の上下に、わずかに興奮している。焦点から発生する発光光がピンホールを通過する間、焦点外のポイントからの放出は、放出ピンホールの前後に収束し、したがってブロックされ、バックグラウンド蛍光が減少します。

励起放出検出サイクルは、いくつかの異なる方法で行うことができる、対象領域の各イメージングポイントに対して繰り返される必要があります。例えば、レーザー走査共焦点は、異なる角度で励起光をそらすガルバノメーター走査ミラーを使用します。したがって、XY平面内の試料を横切って光線を掃引する。スピニングディスクコンフォーカルは、ピンホールの配列を持つディスクを使用し、ピンホールの配置をシフトするために回転します。これにより、ユーザーはサンプル内の複数の小さなイメージングポイントを毎回照らし、ディスクが回転するにつれて領域全体を徐々にカバーできます。ピンホールの結果として、検出器のXY画像は狭いZ平面を表します。したがって、画像は、多くの場合、Z スタックと呼ばれる一連の連続した Z 平面から収集できます。これらの画像から、適切なソフトウェアは、サンプル中の蛍光シグナルパターンの3D描写を生成することができる。

このプロトコルでは、マウス線維芽細胞の免疫染色を観察し、続いて共焦点顕微鏡でイメージングを行い、細胞表面タンパク質とリソソームタンパク質を可視化します。

始めめるために、無菌技術を使用して、ウェル当たり500マイクロリットルの成長培地に目的の細胞を再懸濁し、次に4ウェルチャンバースライドの井戸にそれらを播種する。ここでは、抗原提示分子CD1dを発現するためにトランスフェクトしたマウス線維芽細胞を用いている。細胞がガラスに付着できるように、チャンバースライドを37°Cの5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、一晩インキュベートします。午前中に、各井戸から培布を吸引し、その後、数秒間PBSの500マイクロリットルで一度細胞を洗浄します。

細胞を固定するには、各ウェルに1%のパラホルムアルデヒド溶液の500マイクロリットルを追加し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの後、適切な有害な液体廃棄物容器にパラホルムアルデヒドを収集し、数秒間PBSで細胞を3回洗浄することにより、固定剤の残骸を除去します。

細胞への抗体の浸透を可能にするために、各ウェルに500マイクロリットルの透過性バッファーを追加し、室温で15分間ベンチでインキュベートする。パーメビリゼーション後、500マイクロリットルのPBSで細胞を3回短時間洗浄します。次に、各ウェルに500マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、非特異的抗体結合を防ぐために摂氏4度で1時間インキュベートする。

一次抗体、抗CD1dおよび抗LAMP-1を、適切な作業濃度で調製する。次いで、ウェルからバッファーを吸引し、希釈された一次抗体溶液の500マイクロリットルで各ウェルの細胞を覆い、その後、4°Cで平らな表面に一晩スライドをインキュベートします。翌朝、二次抗体を希釈し、この場合、明確な蛍光タグを有する抗マウスおよび抗ラット抗体を、適切な作業濃度に対する遮断バッファー内で。次に、一次抗体溶液をウェルから吸引し、500マイクロリットルのPBSで細胞を4回洗浄する。次いで、希釈した二次抗体溶液の500マイクロリットルを各ウェルに添加し、暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、500マイクロリットルのPBSでウェルを4回洗浄し、結合のない二次抗体を除去する。

最終洗浄後にサンプルを取り付けるには、慎重に取り外し、スライドからチャンバーを取り外します。残留PBSを除去するには、繊細なタスクワイプの上にスライドを持ち、セルに触れることなくエッジから流体を取り除きます。余分なPBSが除去されたら、核染色DAPIを含むアンチフェード取り付け媒体を1滴、細胞の各セクションに加えます。次に、20×60ミリメートルのカバースリップを取り、指先だけを使用して、細胞上の気泡の形成を避けるために、いずれかのエッジでゆっくりとカバースリップを下げ始めます。デリケートなタスクワイプでスライド上の余分な取り付け媒体を拭き取り、1週間まで室温で暗い状態でスライドを保管します。

セルのイメージングを開始するには、まずデスクトップの NIS ソフトウェア アイコンをクリックします。コントロールウィンドウで上部のTiPadタブをクリックし、画像化の目的を選択します。次に、スライドをセルをステージにロードし、レンズの下に中央に置きます。次に、TiPad タブの横にある A1plus コンパクト GUI タブで、使用する蛍光色素に適したレーザーを設定します。歯車記号をクリックして、色素とスペクトル設定メニューを開きます。色素とスペクトル設定メニューが開いたら、必要なチャンネルを選択し、各チャンネルにレーザーを設定します。次に、最初のダイクロイックミラーの下にあるドロップダウンメニューで適切な排出量を選択します。次に、A1plusコンパクトGUIウィンドウの下で、Ch.Seriesをクリックしてラインチャンネルシリーズを設定し、使用するレーザーがサンプルに同時に発射されるか、順番に発射するかを設定します。

その後、上部の矢印先端アイコンをクリックしてスキャンを開始します。この時点で、イメージングがライブである間、A1plus Compact GUI ウィンドウの下で、スライドスケールをクリックし、ピンホールサイズを変更してピンホールサイズを変更して、ピンホールサイズを変更して、焦点外の光を制限します。次に、スライドスケールを使用して各レーザーの高電圧とオフセットの設定を適切なレベルに調整し、潜在的な背景染色を制限しながら特定の染色を検出できるようにします。正の染色サンプルが利用可能な場合は、レーザー設定が最適な信号対雑音比を得られるように、各チャンネルに対してこのサンプルをイメージングから開始します。各レーザーに最適なHVとオフセット値を設定した後、ND取得タブをクリックし、Zアイコンを選択してZシリーズのパラメータを設定します。

次に、サンプルのライブ画像を取得しながら、まず画像の下部を見つけて下ボタンをクリックして下部を設定します。次に、サンプルの一番上の位置を見つけ、上部ボタンをクリックします。ステップ サイズを、各ステップごとに優先ステップ サイズをミクロンで入力するか、必要な合計ステップ数を指定して、ステップ サイズを設定します。画像の目的のサイズ/ピクセル解像度を選択するには、[Aiplus コンパクト GUI] ウィンドウをクリックし、サイズアイコンの下で目的の解像度を選択します。

画像のノイズを減らすには、theta シンボルの横にあるドロップダウン メニューを選択して、選択した画像数を平均化します。この後、ND 取得メニューの [今すぐ実行] タブをクリックして、サンプルのイメージングを開始します。イメージングが完了したら、ファイルをクリックしてイメージを保存し、次のように保存し、拡張子 dot-nd2 でイメージ ファイルをエクスポートします。最後に、他の各サンプルのプロセスを繰り返します。

この実験では、表面糖タンパク質遺伝子CD1dを発現するマウス線維芽細胞を固定し、免疫染色し、共焦点顕微鏡上で画像化した。この画像は、CD1dが赤で染色された40倍の倍率でZスタックの単一のセクションを示しています。試料を、リソソームマーカーであるLAMP-1を緑色で受け取った。核染色DAPIは、細胞の核を示すために使用された。

3 つの異なるチャネルがマージされる複合イメージでは、赤チャネルと緑チャネルの重なりから黄色の外観が生じ、CD1d と LAMP-1 がリソソームで共局在する領域を示します。1 色のみ存在する領域は、共ローカライズなしで CD1d または LAMP-1 が存在することを示します。この画像は、Z スタックでキャプチャされたイメージから構築されたセルの 3D レンダリングを示しており、このメソッドを使用すると、このセル グループのサイド ビューの構築が可能になります。次の図は、100倍の倍率でZスタックからスライスを示し、これら2つのタンパク質の発現パターンをより詳細に示しています。イメージの右側にあるピンクの輪郭を描いたボックスには、イメージ内のピンクの線で指定された X 座標の断面が表示され、ピンクの線の側面図が表示されます。同様に、イメージの下部にある青い輪郭を描いたボックスは、青い線の正面図を表す青い線で指定された y 座標の断面を示しています。Z スタック イメージの 3D レンダリングにより、ユーザーは 3D でイメージを表示し、X、y、および z 平面をすべて視覚化できます。これは、細胞内の異なる領域における異なる汚れの共局在を研究するために使用することができる。

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