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基于免疫沉淀的技术:使用阿加玫瑰珠纯化内源性蛋白质
 

基于免疫沉淀的技术:使用阿加玫瑰珠纯化内源性蛋白质

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免疫沉淀,或IP,是一种广泛使用的技术,从细胞或组织液中分离感兴趣的蛋白质或体液,用于蛋白质表征或研究蛋白质-蛋白质相互作用。

这个过程从抗体开始,抗体对靶蛋白具有很高的亲和力和特异性。该抗体与样品混合,允许形成抗体靶向复合物。与目标蛋白结合的任何蛋白质也在这个过程中间接附着在抗体上。接下来,该溶液与与细菌蛋白结合的甘蔗珠孵育,对抗体的恒定区域有很强的亲和力。细菌蛋白与抗体结合,并将抗体靶向复合物与珠子连接。然后,对溶液进行离心以沉淀珠子,从而提取包含结合抗体、靶蛋白和任何相互作用蛋白的整个复合物。最后,从珠子中提取结合蛋白,相互释放,通过西印等技术进行进一步分析。

该技术的不同部分的几种变体被普遍使用,如预清除、使用肽标记或磁珠,或分析其他非蛋白结合伙伴。IP 可以通过预清除步骤来预先发现,以去除样品中的非特异性抗体结合蛋白并最小化背景。这涉及首先用等型对照抗体孵育样品,允许它们与这些蛋白质结合,然后使用腺珠来沉淀复合物。然后,该示例已准备好继续到实际 IP。

如果特定抗体不适用于 IP,肽标记非常有用。在这里,靶蛋白可以进行基因改造,以包含肽表位标记,而针对该标记的抗体能够提取感兴趣的蛋白质。磁珠通常用代替甘蔗来沉淀目标。与抗体靶向复合物结合后,样品管被放置在强磁场中,从溶液中提取珠子。这消除了离心的需要,提高了速度和便利性。

免疫沉淀也用于研究DNA或RNA结合蛋白,分别称为染色质免疫沉淀和RNA免疫沉淀。这些变体可用于针对不同的实验应用进行故障排除和调整方法。在本视频中,您将观察如何预先清除细胞解液并执行免疫沉淀以提取感兴趣的蛋白质,然后进行西方污点分析以验证实验。

首先,将预收集的细胞置于微离心机中,以13000rpm转速旋转三分钟。旋转后,取出上清液,然后用PMSF将细胞重新悬浮在500微升的裂变缓冲RIPA中。现在,使用几个带有漩涡的快速脉冲破坏细胞,然后用25号针连接到注射器吸气几次,注意避免产生气泡。将细胞放在冰上15分钟。在冰上孵育样品后,在4摄氏度的温度下将莱沙发生15分钟的离心机。

标记一个新的1.5毫升微离心管。旋转后,将上清液转移到新标记的管子上,然后丢弃颗粒。接下来,通过在解结中加入 20 微升的蛋白质 A/G PLUS-agarose 珠和一个同型对照抗体的微克,预先清除非特有结合到角胶珠或原抗体的污染物的解结。例如鼠标 IgG1 等向控件。在冷室的旋转器上孵育管子30分钟。在冷室中旋转了30分钟后,在3200rpm转速下将样品离心30秒,温度为4摄氏度。从离心机中取出管,并将预清除的上清液转移到新的标记为 1.5 毫升的微离心管中。丢弃颗粒。

现在,通过执行布拉德福德测定测定细胞莱沙酸的蛋白质浓度。标签七 1。5毫升微离心管一到六,样品和等分1000微升的布拉德福德试剂进入每个管。六个管将用于通过在每个管中添加各种数量的已知BSA来构成标准曲线。要添加的金额列在此表中。在第七个样品管中,加入一微升的预清除莱沙。将七根管子中的200微升放入平底96孔板的单独井中,重复三重样品,使七个样品中有三列。使用 595 纳米的波长读取板读取板上的板。在 Excel 中创建标准曲线后,计算预清除的莱沙的蛋白质浓度。

接下来,将两个1.5毫升的微离心管标记为控制,另一个作为测试,在此示例中,它将是c-myc抗体。将500微克的预清除莱沙液放入每个管中,然后用莱沙缓冲液将每管的总体积达到500微升。接下来,在测试组管中加入两微克的抗c-myc抗体。对于对照组,添加两微克小鼠IgG1等型对照抗体。一旦抗体被添加到管中,将样品放在冷室的旋转器上,孵育两小时。现在,添加腺珠。为此,建议切断移液器尖端的末端,然后,使用此改性尖端,在每个管中加入 200 微升的蛋白质 A/G PLUS-agarose 珠子。在寒冷的房间里过夜,在旋转器上孵育管子。

孵育后,从旋转器中取出管子,旋转微离心机中的分解物以拉下珠子。旋转完成后,从离心机中取出管子,并从每个管中吸出上清液。接下来,用 500 微升的 1X Dulbecco 的 PBS 清洗珠子。将管子放在微型离心机中,在4摄氏度下旋转30秒。接下来,删除上清液。重复清洗和离心机步骤一次共两次。从微离心机中取出管子,并从每个管中吸出缓冲液。使用凝胶加载技巧,从珠子上去除任何留在缓冲液上,将珠子留在冰上,使结合的蛋白质脱脂。

在此示例中,通过沸腾进行西方斑点分析,将蛋白质洗脱到 SDS-PAGE 运行缓冲液中。为此,将含有β-汞醇(BME)的20微升SDS-PAGE加载染料中重新悬浮。将样品在95摄氏度下煮沸5分钟,使免疫复合物与珠子分离。然后,在室温下以最大速度将珠子离心10秒。从微型离心机中取出管子,并在室温下将其放在机架中。使用凝胶加载头,小心移液从珠子样品,并加载到4至15%梯度SDS-PAGE凝胶的井。除了样品外,还装载带有蛋白质梯的车道以及带有预清除的莱沙的车道,以用作装载控制。一旦凝胶加载,运行凝胶在100伏特。

染料正面到达凝胶底部后,大约需要一个小时,停止凝胶并制作西印体三明治,确保PVDF膜位于凝胶和阴极之间。将西印体三明治放入转移装置中,在100伏特下将凝胶上的蛋白质转移到膜上一小时。转移完成后,将膜置于五毫升的块中,以防止抗体非特立结合膜。在室温下在低温度下摇动一小时。当计时器响起时,删除阻塞缓冲区。在膜中加入五毫升的阻滞缓冲液,并加入检测抗体。在这里,使用一种与下拉的抗体不同的抗c-myc抗体。

在夜间孵育斑点,在低环境的摇臂上摄氏四度。孵育后,取出抗体并阻塞缓冲液。在室温下,在低设置的摇杆上清洗斑点,在室温下使用五毫升的TBST五分钟。这种洗涤步骤应重复两到五次,共三到六次洗涤,每次洗涤使用新鲜的TBST。加入5毫升的1至1000二次抗体,并阻止缓冲液到斑点。在这种情况下,二次抗体是HRP标记的抗兔光链。在室温下,在低设置下在摇杆上孵育斑点。接下来,取出缓冲液,用五毫升的TBST洗去污液。在室温下,在低设置下在摇杆上孵育此洗涤液五分钟。重复这种洗涤共6至12洗,每个与新鲜的5毫升的TBST。先将液体从污液中浇注,取出最终洗涤液。然后,使用钳子,在实验室擦拭上涂抹斑点的边缘,去除多余的液体,然后将污液放入一个新的容器中。接下来,用1倍化学发光检测试剂覆盖斑点,孵育一分钟。

快速工作,在实验室擦拭上涂抹斑点的边缘,取出任何多余的检测试剂,然后将污点放在成像器托盘的成像表面上。使用化学发光程序捕获 10 到 30 秒的多个时间点的图像。对污点进行成像后,选择具有最佳波段可见性的图像,然后导出该图像。在移动污点之前,使用成像器拍摄污点的照片以捕获梯子的位置。然后,也导出该图像。最后,使用幻灯片准备软件(如 PowerPoint)将波段和梯形图像对齐以形成一个图像。

这张图片显示了从胸腺细胞中免疫沉淀蛋白质c-myc的西方斑点结果。从左到右,通道表示等型控制、c-myc IP 和预先清除的裂化输入。最右边的车道是分子量梯的合并图像。强带,在25千道尔顿左右来自轻链,一个在50千道尔顿是从结合抗体的重链,是非特定于IP或样品。C-myc在西斑上运行约67千吨,通常可以看到在75千道尔顿梯带以下。在此印块中,c-myc 波段在第二条通道中可见,但在第一通道中不存在,表明 IP 抗体成功拉下 c-myc。在预清除的莱沙内巷没有可见的带状,这表明这种蛋白质具有低内源表达水平。

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