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Analyse du cycle cellulaire : Évaluation de la prolifération des lymphocytes T CD4 et CD8 après stimulation à l'aide de la tonte et de la cytométrie de flux DE CFSE

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Pour la plupart des études d'immunologie, la mesure de la prolifération des cellules immunitaires est une étape clé et la méthode à base de colorant fluorescent CFSE est couramment utilisée. La division cellulaire appropriée est importante pour les cellules immunitaires car elle régule à la fois les niveaux et la spécificité d'une réponse immunitaire. Par exemple, les lymphocytes T prolifèrent pour identifier et tuer les cellules cancéreuses et les cellules B subissent une division cellulaire pour produire des anticorps spécifiques. La prémisse générale de l'analyse CSFE consiste à tacher les cellules avec le colorant fluorescent vert CFSE, qui pénètre dans les cellules vivantes et se lie de façon stable aux protéines à l'intérieur, ce qui entraîne un étiquetage permanent. Par conséquent, lorsque la cellule parente contenant de la teinture se divise, chaque cellule de fille obtient la moitié de la fluorescence de la cellule parente.

Ce processus se poursuit dans les divisions suivantes avec l'intensité de colorant diminuant progressivement avec chaque division. Au point d'extrémité souhaité, l'intensité de fluorescence de chaque cellule est mesurée par cytométrie de flux. Ces données sont ensuite utilisées pour quantifier le nombre et le modèle des divisions que les cellules ont vécues. Comme le montre ici, la population cellulaire avec la fluorescence la plus élevée est de la génération parente. La deuxième plus haute appartient à la deuxième génération et ainsi de suite. Le nombre de pics détermine le nombre de divisions cellulaires.

En outre, si des cellules immunitaires primaires sont utilisées, des populations cellulaires spécifiques, comme les lymphocytes T par exemple, peuvent être étiquetées avec un colorant de fluorescence de couleur différente avec CFSE, et simultanément identifiées à l'aide de la cytométrie multicolore. Les nouvelles données peuvent être tracées sur le même graphique, montrant maintenant la sous-population de lymphocytes T avec différentes intensités de coloration CFSE, par laquelle le taux de prolifération des lymphocytes T peut être spécifiquement analysé. Cette vidéo démontre le protocole pour la coloration CFSE des splenocytes de souris, qui sont stimulés avec un anticorps anti-CD3. Ceci est suivi par la coloration pour étiqueter les lymphocytes T et la cytométrie de flux pour suivre leur prolifération cellulaire.

Pour commencer, enfilez des vêtements de protection et des gants de laboratoire appropriés. Ensuite, lavez une paire de forceps et disséquez les ciseaux d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis essuyez-les avec un essuie-tout propre. Préparer 50 millilitres de Hank's Balanced Salt Solution, ou HBSS, avec une concentration de 2% de sérum fœtal de veau, ou FCS, en combinant un millilitre de FCS avec 49 millilitres de HBSS dans un tube de 50 millilitres. Mélanger en pipeting doucement la solution vers le haut et vers le bas environ 10 fois. Ensuite, isolez les cellules de la rate de souris comme démontré dans le protocole vidéo pour l'isolement FACS des lymphocytes B spléniques.

Étiquetez quatre tubes de 15 millilitres un à quatre et ajoutez une fois 10 aux septièmes cellules de rate isolées. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS à chaque tube. Ensuite, pipette un microlitre de cinq micromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester, ou CFSE, dans chaque tube. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant 10 minutes. Les cellules dans les tubes un et deux ne seront pas stimulées. Ils seront utilisés pour révéler le niveau basal de prolifération des lymphocytes T CD4 et CD8.

Pipette 10 millilitres de HBSS 2% FCS dans ces tubes. Les tubes trois et quatre seront stimulés par des anticorps anti-CD3 afin d'observer les effets sur le cycle cellulaire. Ajouter 10 millilitres de HBSS 2% FCS et anti-CD3 anticorps à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre aux tubes trois et quatre. Ensuite, centrifuger tous les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les supernatants. Resuspendre les granulés en deux millilitres de HBSS 2% FCS et pipette les solutions résultantes en puits séparés sur une plaque de six puits. Étiquetez soigneusement la plaque de un à quatre pour garder une trace des identités de l'échantillon. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 pendant trois jours.

Le troisième jour, ajouter deux millilitres de HBSS 2% FCS aux puits un et trois, qui devraient contenir les cellules des tubes un et trois. Pipette de haut en bas vigoureusement, puis transférer les échantillons dans les tubes étiquetés de cinq millilitres FACS. Remettre la plaque de six puits dans l'incubateur. Ces cellules restantes des puits deux et quatre seront analysées le cinquième jour pour étudier les effets à long terme de la stimulation sur le cycle cellulaire. Centrifuger les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jeter les supernatants. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de mélange d'anticorps à chaque tube. Incuber les tubes pendant 20 minutes sur la glace dans l'obscurité. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS 2% FCS à chaque tube et centrifugez les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les supernatants. Resuspendre les granulés dans 200 millilitres de HBSS 2% FCS et bien mélanger. Transférer les granulés resuspendus sur de nouveaux tubes FACS étiquetés.

Ensuite, évaluez la prolifération des lymphocytes T à l'aide de la cytométrie du débit, comme le montre le protocole FACS. Portez les cellules pour sélectionner les cellules lymphoïdes CD3-positives et pour distinguer les cellules CD4-positives et CD8-positives, et enregistrez les données pour des tubes un et trois. Le cinquième jour, répétez le processus de coloration cellulaire avec les cellules des deux puits restants de la plaque de six puits.

Nous analyserons les effets de la stimulation CD3 sur le cycle cellulaire des cellules CD4 et CD8-positives à trois jours et cinq jours après la stimulation. Pour commencer, cliquez sur l'icône FlowJo et faites glisser vos fichiers dans la fenêtre All Sample. Double-cliquez sur le fichier pour les cellules non stimulées recueillies le troisième jour pour afficher une parcelle de point avec la diffusion vers l'avant sur l'axe y et la diffusion latérale sur l'axe x. Cliquez sur le polygone pour faire le tour des populations de lymphocytes en fonction de leur morphologie. Dans la fenêtre d'identification des sous-populations, nommez les lymphocytes de la population et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée et dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Thy1.2 sur l'axe y et CD3 sur l'axe x. Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler les cellules CD3 et Thy1.2 double positif. Dans la nouvelle fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population T-Cells et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD4 sur l'axe y et CD8 sur l'axe x. Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler la population positive au CD4. Dans la nouvelle fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population CD4 T-Cells et cliquez sur OK. Maintenant, cliquez sur le polygone pour encercler la population positive au CD8. Dans la nouvelle fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population CD8 T-Cells et cliquez sur OK. Répétez ces étapes avec les autres fichiers.

Pour déterminer les fréquences de division et de non-division des cellules, d'abord, visualisez les populations cellulaires en cliquant sur Layout Editor. Ensuite, faites glisser les lymphocytes T CD4 et Les lymphocytes T CD8 de chacun des quatre tubes à la fenêtre All Sample. Des graphiques représentant vos populations apparaîtront. Pour chaque tube, cliquez en double sur la parcelle de points pour les lymphocytes T CD8 et sélectionnez Histogramme sous définition graphique pour visualiser les résultats. Sélectionnez LE CFSE comme paramètre pour comparer les populations de cellules stimulées par rapport aux populations cellulaires non stimulées à chaque moment. Les cellules non-divisantes maintiennent des niveaux plus élevés de CFSE tandis que les cellules proliférantes divisent le contenu de CFSE en cellules de division.

Maintenant, tout en appuyant sur la touche Shift, double-cliquez sur l'histogramme. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur la plage et sélectionnez la plage de CFSE correspondant au pic le plus élevé. Dans la fenêtre d'identification des sous-populations, nommez la population Non-Diviser les lymphocytes T CD8 et étiquetez la population Diviser les cellules CD8. Maintenant, répétez pour sélectionner les lymphocytes T CD4 de division et de non-division dans chaque tube. Pour examiner la fréquence de la division des cellules CD3-positives, cliquez sur L'éditeur de table. Ensuite, faites glisser les populations d'intérêt, en divisant les lymphocytes T CD8 et en divisant les lymphocytes T CD4, dans la table. Sur le menu Statistique, sélectionnez Fréquence des lymphocytes T. Ensuite, cliquez sur Créer la table pour révéler la fréquence dans une nouvelle table.

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