Overview
מקור: פרצ'טתיבו 1,2,3, מונירסילבן 1,2,3, סופי נובאלט4, רחל גולוב1,2,3
יחידה אחת ללימפוזיס, המחלקה לאימונולוגיה, מכון פסטר, פריז, צרפת
2 INSERM U1223, פריז, צרפת
3 100é Paris Diderot, סורבון פריז סיטה, צ'רול פסטר, פריז, צרפת
4 פלטפרום ציטומטריה זרימה, ציטומטריה וסמנים ביולוגיים UtechS, המרכז למדע תרגום, מכון פסטר, פריז, צרפת
מחזור התא הוא תהליך חיים אוניברסלי. במהלך מחזור התא, תא עובר מספר שינויים כדי לחלק לשני תאי בת. מנגנון זה מתרחש לאורך כל חייו של אורגניזם בתגובה לצרכיו. חלוקות תאים והתפתחות עוברית מייצרות אורגניזם מלא מזיגוטה חד-תאית. במהלך הבגרות, מחזור התא הוא מרכזי בתהליכים ביולוגיים קריטיים רבים, כגון תיקוני רקמות.
מנגנונים של חלוקת תאים הם אירועים מבוקרים היטב שבהם התא עובר שינויים צעד לפני החלוקה הסופית. תאים שעדיין לא נמצאים במחזור מתוארים כשם הם בשלב Gap 0 (G0). בשלב זה התא נחשב לתקופתון. כאשר התא מתחיל מחזור, ארבעה שלבים נפרדים מזוהים: פער 1 (G1), סינתזה(S), פער 2 (G2) ומיטוזה (M). שלב G1 הוא נקודת ביקורת למשאבים הדרושים על ידי התא לסינתזת DNA. לאחר מכן, שלב S מתרחש, ושכפול DNA מתחיל, ואחריו אינטרפאזה G2, נקודת ביקורת נוספת השולטת בכל האלמנטים הדרושים כדי שהתא יתחלק. לבסוף, התא נכנס מיטוזה ומתחלק לשני תאי בת.
חלוקת תאים היא פרמטר אינפורמטיבי ביותר במערכות ביולוגיות רבות ושונות. בתחום החיסונים, ניתוח של התפשטות לויקוציטים יכול להצביע על מנגנון התגובה החיסונית. תחומי חקירה אחרים מסתמכים גם הם על ניתוח מחזור תאים. לדוגמה, ניתוח מחזור התא במהלך התפתחות הגידול שיפר את הבנתנו את הסרטן.
צבעים פלואורסצנטיים רבים זמינים כעת למעקב אחר התפשטות תאים. צבעים אלה שונים בתכונות הכימיות והספקטרליות שלהם. קיימים שני סוגים שונים של צבעים: צבעי חלבון משתלבים לצמיתות עם חלבון על ידי יצירת קשר קוולנטי, וצבעי ממברנה מתערבבים ביציבות בתוך קרום התא באמצעות אסוציאציות הידרופוביות חזקות. אין ויטרו ומחקרים in vivo של התפשטות תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה הם בין היישומים הנפוצים ביותר של שני סוגים של צבעי מעקב אחר תאים (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) הוא צבע פלואורסצנטי המסמן חלוקת תאים. בתחילה, כל התאים מקבלים את אותה כמות צבע; חלוקת תאים באופן שווה לפצל את הצבע שהם קיבלו בין שני תאי הבת שלהם. כתוצאה מכך, מחזור התא יכול להיות ואחריו ירידה הדרגתית של עוצמת הצבע בתאים. כתמי CFSE מלווה בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית קונבנציונלית, טכנולוגיה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת אפיון פנוטיפי ותפקודי של תאים בהתבסס על מידת הכתמת CFSE שלהם (3).
בניסוי הבא, אנו מעריכים את ההתפשטות של CD4+ ו CD8+ תאי T במבחנה, בעקבות גירוי CD3, באמצעות כתמי CFSE וציטומטריית זרימה.
Procedure
1. הכנה
- לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
- לחטא את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן לנגב אותם יבש ביסודיות.
- הכן 50 מ"ל מתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה סרום עגל עוברי 2% (FCS).
2. ניתוח
- באמצעות מערכת אספקת פחמן דו חמצני, להרדים את העכבר על ידי היפוקסיה. אבטחו את העכבר המתת חסד על צלחת ניתוח בתנוחת העפרוניזציה ובצעו לפרוסטומיה אורך באמצעות מספריים ומלקחיים.
- באמצעות מלקחיים, להזיז את המעיים ואת הבטן בצד ימין של הבטן כדי לחשוף את הבטן ואת הטחול. הטחול מחובר לקיבה.
- באמצעות מלקחיים בזהירות לנתק את הטחול מן הבטן ומניחים אותו בצלחת פטרי המכיל 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.
3. בידוד תאי מערכת החיסון
- מניחים את הטחול על מסננת תא 40 מיקרומטר על אותה צלחת פטרי. למחוץ את הטחול עם בוכנה כדי לנתק אותו.
- מעבירים את הטחול והמנותק לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
- resuspend הכדור ב 2 מ"ל של אשלגן אצטט ליזה אריתרוציטים. המתן 2 דקות ולאחר מכן האיפור את עוצמת הקול עד 15 מ"ל באמצעות HBSS 2% FCS.
- צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.
- ספירת התאים באמצעות בדיקות כתמים כחולות טריפן ולהתאים את ריכוז התא הסופי ל 107 תאים / מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.
4. כתמי CFSE וגירוי תאי T
- להפיץ 107 תאי טחול מבודדים / צינור ב 4 צינורות (15 צינורות מ"ל, שכותרתו 1 עד 4)
- הוסף 3 מ"ל HBSS 2%FCS לכל צינור.
- הוסף 1 μL של CSFE בכל צינור (ריכוז סופי - 5 מיקרומטר).
- לדגור על הצינורות ב 37 °C בחממה 5% CO2 במשך 10 דקות.
- בצינורות 3 ו -4, להוסיף 12 מ"ל של HBSS 2% FCS + נוגדן נגד CD3 בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל. צינורות 3 ו -4 להיות מגורה באמצעות נוגדן אנטי CD3, כדי לבחון את ההשפעה על מחזור התא.
- בצינורות 1 ו 2 להוסיף 12 מ"ל של HBSS 2% FCS. התאים בצינורות 1 ו -2 לא יהיו מגורה.
- צנטריפוגה כל הצינורות ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. זרוק את אנטנטי העל.
- resuspend הכדורים ב 2 מ"ל של HBSS 2%FCS.
- מעבירים את הפתרונות המתקבלים לבארות נפרדות על צלחת של 6 בארות.
- לדגור על התאים ב 37°C, 5% CO2 במשך 3 ימים.
5. כתמי תאים
- ביום 3, הוסף 2 מ"ל HBSS 2%FCS בבאר 1 ו-3.
- Pipet במרץ ולהעביר את הדגימות לתוך 5 mL FACS צינורות.
- המשך לדגורת התאים הנותרים מבארות 2-4 ב 37 °C, 5% CO2. הם ינותחו ביום 5 כדי לחקור את ההשפעות ארוכות הטווח של גירוי על מחזור התא.
- צנטריפוגות הצינורות ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 °C. זרוק את אנטנטי העל.
- הוסף 100 μL של תערובת נוגדנים (ראה טבלה 1) לכל צינור.
| נוגדן | פלואורוכרום | דילול |
| CD3 | פסיפיק בלו | 1/100 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD8 | PE | 1/400 |
| 1.2 שלך | BV605 | 1/400 |
טבלה 1: הרכב תערובת נוגדנים. ארבע תכשירי קוקטייל נוגדנים באמצעות מצומדים נוגדנים-פלואורסצנטיים מרוכזים ו- HBSS.
- לדגור על הצינורות במשך 20 דקות על קרח בחושך.
- הוסף 1 מ"ל של HBSS 2%FCS וצנטריפוגות הצינורות ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 °C.
- להשליך את supernatant ו resuspend הכדורים ב 200 μL של HBSS 2% FCS.
- העבר את הכדורים המותנים מחדש לצינורות FACS חדשים ומסומנים.
- הערך התפשטות תאי T באמצעות FACS.
- ביום 5, חזור על תהליך הכתמת התא עם התאים משתי בארות הנותרות של צלחת 6-well.
6. ניתוח נתונים
- פתח את תוכנת "FlowJo" וגרור את הקבצים לחלון "כל הדוגמה".
- לחץ פעמיים על הקובץ עבור תאים לא מגויים שנאספו ביום 3 כדי להציג התוויית נקודה עם פיזור קדימה על ציר Y ופיזור צד על ציר X.
- לחץ על "מצולע" וליצור אסטרטגיית gating כדי לבחור תאי לימפה, Thy1.2+ CD3+ תאים ולהבדיל CD4+ ו CD8+ תאים (ראה איור 1).
איור 1: אסטרטגיית גטינג. התאים מגודרים תחילה על סמך המורפולוגיה שלהם (משמאל: FSC-A, SSC-A). תאי T מגודרים לאחר מכן (אמצע: CD3, Thy1.2) ומחולקים עוד יותר בתאי CD4+ T (כתומים) ובתאי CD8+ T (כחול) (מימין: CD4, CD8). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- חזור על השלבים עם קבצים אחרים.
- כדי לקבוע את התדרים של חלוקת תאים שאינם מתחלקים, תחילה דמיין את אוכלוסיות התאים על-ידי לחיצה על"עורך הפריסה".
- גרור את תאי CD4 T ותאי CD8 T מכל אחד מארבעת הצינורות אל "כל חלון הדגימה"
- גרפים המייצגים כל אוכלוסייה יופיעו.
- השתמש בהיסטוגרמה כדי לדמיין את התוצאות ולבחור "CFSE" כפרמטר להשוואה של הצינורות השונים והאוכלוסיות השונות.
- תאים שאינם מתחלקים שומרים על רמות גבוהות יותר של CFSE, בעוד שתאים מתרבים מפצלים את התוכן של CFSE לחלק תאים
- צור שער על תאים שאינם מתחלקים וליישם אותו בכל הצינורות.
- צור שער על תאים מתחלקים וליישם אותו בכל הצינורות.
- כדי לבחון את התדירות של חלוקת תאי CD3+ , לחץ על"עורך טבלאות."
- גרור את האוכלוסיות של עניין - חלוקת תאי T CD8 וחלוקת תאי T CD4 - לתוך"טבלה."
- בתפריט "סטטיסטיקה", בחר "תדירות תאי T"ולאחר מכן לחץ על " צורטבלה" כדי לחשוף את התדירות בטבלה חדשה.
- לחץ על"צור טבלה." כדי לחשוף את ערכי התדירות, מופיעים בטבלה חדשה.
עבור רוב המחקרים אימונולוגיה, מדידת התפשטות של תאי מערכת החיסון היא צעד מפתח ואת שיטת CFSE פלורסנט מבוסס צבע משמש בדרך כלל. חלוקת תאים נכונה חשובה לתאי מערכת החיסון שכן היא מסדירה הן את הרמות והן את הספציפיות של תגובה חיסונית. לדוגמה, תאי T מתרבים לזהות ולהרוג תאים סרטניים ותאי B עוברים חלוקת תאים כדי לייצר נוגדנים ספציפיים. הנחת היסוד הכללית של מצודת CSFE כוללת הכתמת התאים עם צבע פלואורסצנטי ירוק CFSE, אשר נכנס לתאים חיים ונקשר ביציבות לחלבונים בפנים, וכתוצאה מכך תיוג קבוע. כתוצאה מכך, כאשר תא האב המכיל את הצבע מתחלק, כל תא בת מקבל חצי פלואורסצנטיות מתא האב.
תהליך זה ממשיך בחטיבות הבאות עם עוצמת הצבע יורדת בהדרגה עם כל חטיבה. בנקודת הקצה הרצויה, עוצמת הפלואורסצנטיות של כל תא נמדדת על ידי ציטומטריית זרימה. נתונים אלה משמשים לאחר מכן לכימות המספר והתבנית של החלוקות שעברו התאים. כפי שמוצג כאן, אוכלוסיית התאים עם הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר היא מדור האב. השני בגובהו שייך לדור השני וכן הלאה. מספר הפסגות קובע את מספר חלוקות התאים.
בנוסף, אם נעשה שימוש בתאי מערכת החיסון העיקריים, אוכלוסיות תאים ספציפיות, כמו תאי T למשל, יכולות להיות מסומנות בצבע פלואורסצנטיות צבעוני שונה יחד עם CFSE, ולזהות בו זמנית באמצעות ציטומטריית זרימה צבעונית. ניתן להתוות את הנתונים החדשים על אותו גרף, המציג כעת את תת-אוכלוסיית תאי ה- T עם עוצמות מכתימות מכתימות שונות של CFSE, שבאמצעותן ניתן לנתח באופן ספציפי את קצב ההתפשטות של תאי ה- T. וידאו זה מדגים את הפרוטוקול להכתמת CFSE של טחול עכבר, אשר מגורה עם נוגדן אנטי CD3. זה ואחריו כתמים לתייג תאי T וציטומטריית זרימה כדי לעקוב אחר התפשטות התא שלהם.
ראשית, לבשו ביגוד מגן מתאים וכפפות מעבדה. לאחר מכן, לשטוף זוג מלקחיים ניתוח מספריים תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן לנגב אותם יבש עם מגבת נייר נקי. הכן 50 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת של האנק, או HBSS, עם ריכוז של 2% של סרום עגל עוברי, או FCS, על ידי שילוב מיליליטר אחד של FCS עם 49 מיליליטר של HBSS בצינור 50 מיליליטר. מערבבים על ידי צנרת עדינה של התמיסה למעלה ולמטה בערך 10 פעמים. לאחר מכן, לבודד תאי טחול עכבר כפי שהודגם בפרוטוקול הווידאו לבידוד FACS של לימפוציטים B-לימפוציטים.
סמן ארבעה צינורות 15 מיליליטר אחד עד ארבעה ולהוסיף פעם אחת 10 לתאי הטחול המבודד השביעי. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של HBSS 2% FCS לכל צינור. לאחר מכן, pipette microliter אחד של חמישה micromolar carboxyfluorescein succinimidyl אסתר, או CFSE, לתוך כל צינור. לדגור על הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה 5% פחמן דו חמצני במשך 10 דקות. התאים בצינורות 1 ו-2 לא יהיו מגורים. הם ישמשו כדי לחשוף את רמת ההתפשטות הבזלית של תאי T טחול CD4 ו- CD8.
פיפטה 10 מיליליטר של HBSS 2% FCS לתוך צינורות אלה. צינורות שלוש וארבע יהיו מגורה על ידי נוגדן אנטי CD3 על מנת לבחון את ההשפעות על מחזור התא. הוסף 10 מיליליטר של HBSS 2% FCS ונוגדן נגד CD3 בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר לצינורות שלוש וארבע. לאחר מכן, צנטריפוגה כל הצינורות ב 370 x g במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס. זרוק את אנטנטי העל. resuspend הכדורים בשני מיליליטר של HBSS 2% FCS ו pipette הפתרונות המתקבלים לתוך בארות נפרדות על צלחת שש בארות. סמן בזהירות את הצלחת מאחד עד ארבעה כדי לעקוב אחר זהויות לדוגמה. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך שלושה ימים.
ביום השלישי, להוסיף שני מיליליטר של HBSS 2% FCS לבארות אחת ושלוש, אשר צריך להכיל את התאים מצינורות אחד ושלוש. פיפטה למעלה ולמטה במרץ ולאחר מכן להעביר את הדגימות לתוך תוויות FACS חמישה מיליליטר. מחזירים את צלחת ששת הבארות לאינקובטור. תאים אלה הנותרים מבארות שתיים וארבע ינותחו ביום החמישי כדי לחקור השפעות ארוכות טווח של גירוי על מחזור התא. צנטריפוגות הצינורות ב 370 x g במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatants. עכשיו, להוסיף 100 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים לכל צינור. לדגור על הצינורות במשך 20 דקות על קרח בחושך. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של HBSS 2% FCS לכל צינור צנטריפוגה הצינורות ב 370 x g במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס. זרוק את אנטנטי העל. להשעות מחדש את הכדורים ב 200 מיליליטר של HBSS 2% FCS ולערבב היטב. העבר את הכדורים המותנים מחדש לצינורות FACS חדשים המסומנים.
לאחר מכן, להעריך את התפשטות תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה כפי שמוצג בפרוטוקול FACS. שער התאים כדי לבחור תאים חיוביים CD3 לימפה ולהבדיל CD4-חיובי CD8-חיובי תאים, ולרשום את הנתונים עבור צינורות אחד ושלוש. ביום החמישי, חזור על תהליך הכתמת התא עם התאים משתי בארות הנותרות של הצלחת בעלת ששת הבארות.
אנו ננתח את ההשפעות של גירוי CD3 על מחזור התא של CD4 ו CD8-חיובי תאים בשלושה ימים וחמישה ימים לאחר גירוי. כדי להתחיל, לחץ על סמל FlowJo וגרור את הקבצים שלך לחלון כל הדוגמה. לחץ פעמיים על הקובץ עבור התאים הלא מנוסים שנאספו ביום השלישי כדי להציג תרשים נקודה עם פיזור קדימה על ציר ה- y ופיזור הצד בציר ה- x. לחץ על מצולע כדי להקיף את אוכלוסיות הלימפוציטים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם. בחלון זיהוי תת-אוכלוסיה, תן שם ללימפוציטים של האוכלוסייה ולחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה ובחלון החדש, בחר Thy1.2 בציר ה- y וב- CD3 בציר ה- x. לאחר מכן, לחץ על מצולע כדי להקיף את CD3 ו Thy1.2 תאים חיוביים כפולים. בחלון זיהוי תת-אוכלוסיות חדש, תן שם לאוכלוסיית תאי T ולחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה. בחלון החדש, בחר CD4 בציר ה- y וב- CD8 בציר ה- x. לאחר מכן, לחץ על מצולע כדי להקיף את האוכלוסייה החיובית CD4. בחלון זיהוי תת-אוכלוסיה חדש, תן שם לתאי T של CD4 של האוכלוסייה ולחץ על אישור. עכשיו, לחץ על מצולע כדי להקיף את האוכלוסייה CD8 חיובי. בחלון זיהוי תת-אוכלוסיה חדש, תן שם לתאי T של CD8 של האוכלוסייה ולחץ על אישור. חזור על שלבים אלה עם הקבצים האחרים.
כדי לקבוע את התדרים של חלוקת תאים שאינם מתחלקים, תחילה, הצג באופן חזותי את אוכלוסיות התאים על-ידי לחיצה על עורך הפריסה. לאחר מכן, גרור את תאי ה- CD4 T ותאי ה- T של CD8 מכל אחד מארבעת הצינורות לחלון כל הדגימה. גרפים המייצגים את האוכלוסיות שלך יופיעו. עבור כל צינור, לחץ פעמיים על התוויית הנקודות עבור תאי T CD8 ובחר היסטוגרמה תחת הגדרת גרף כדי לדמיין את התוצאות. בחר CFSE כפרמטר כדי להשוות את אוכלוסיות התאים המוערמות לעומת לא מעוררות בכל נקודת זמן. תאים שאינם מתחלקים שומרים על רמות גבוהות יותר של CFSE ואילו תאים מתרבים מפצלים את התוכן של CFSE לתאים מתחלקים.
עכשיו, תוך כדי לחיצה על מקש Shift, לחץ פעמיים על היסטוגרמה. בחלון החדש, לחץ על טווח ובחר את טווח CFSE המתאים לשיא הגבוה ביותר. בחלון זיהוי אוכלוסיות משנה, תן שם לאוכלוסייה שאינם מחלקים תאי T CD8 ותייג את האוכלוסייה המחלקת תאי CD8. כעת, חזור על הפעולה כדי לבחור את תאי ה- T המפרידים והלא מתחלקים בכל צינור. כדי לבחון את התדירות של חלוקת תאים חיוביים ל- CD3, לחץ על עורך הטבלאות. לאחר מכן, גרור את האוכלוסיות העניין, חלוקת תאי T CD8 וחלוקת תאי T CD4, לטבלה. בתפריט סטטיסטיקה, בחר תדירות של תאי T. לאחר מכן, לחץ על צור טבלה כדי לחשוף את התדירות בטבלה חדשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
בניסוי זה, עקבנו אחר התפשטות של תאי CD4וטחול + ו- CD8+ T בתרבית במבחנה. לאחר 3 ימים, לא ראינו התפשטות חזקה הן CD4+ ו CD8+ T תאים עם או בלי גירוי. ניתן לראות זאת בחלונית העליונה של איור 2, שבו הפסגות של CSFE אינן יורדות. עם זאת, לאחר 5 ימים התחלנו לראות התפשטות בשתי האוכלוסיות, מה שניכר מירידה בפסגות ה-CSFE (לוחות תחתוניים, איור 2). כתמי CFSE, מדגים בבירור כי הן CD4+ ו CD8+ T תאים היו מתחלקים יותר לאחר גירוי. בנוסף, תאי CD8+ T נראה קצת יותר מרבה מאשר CD4+ תאי T לאחר 5 ימים של גירוי.
איור 2: התפשטות תאי CD4 לעומת CD8 T. התפשטות תאי T ביום 3 (פאנל עליון) וביום 5 (החלונית התחתונה). מחזור התא מושווה בין תאי CD4 ו- CD8 T עם או בלי גירוי ביומיים שונים. תאי CD4 ו- CD8 T מתרבים יותר כאשר הם מגורים. תאי T מגורה CD8 מתרבים יותר מתאי T מגורה CD4 ביום 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
התקפות התפשטות משמשות לעתים קרובות בתחומים שונים כגון אימונולוגיה כדי לקבוע את מידת ההפעלה של תאים. זה מבוצע גם באבחון אונקולוגי כדי לקבוע תוקפנות הגידול בחולים. כתמי CFSE היא טכניקה שימושית כדי לעקוב אחר התפשטות אוכלוסיות תאי החיסון לאורך זמן. שיטות אחרות מאפשרות אפיון של מחזור התא. BrdU, שווה ערך של CFSE משולב רק בחלוקת תאים. מודל העכבר האחרון של Fucci אפילו מאפשר זיהוי של שלבי מחזור התא, ללא כתמים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
- Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
- Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).
