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細胞周期分析:CFSE染色と流れサイトメトリーを用いた刺激後のCD4およびCD8 T細胞増殖の評価

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ほとんどの免疫学研究では、免疫細胞の増殖を測定することは重要なステップであり、CFSE蛍光色素ベースの方法が一般的に使用されています。適切な細胞分裂は、免疫応答のレベルと特異性の両方を調節するので、免疫細胞にとって重要です。例えば、T細胞は増殖して癌細胞を同定し、殺し、B細胞は特異的抗体を産生する細胞分裂を受ける。CSFEアッセイの全体的な前提は、生細胞に入り、内部のタンパク質に安定的に結合する緑色蛍光色素CFSEで細胞を染色し、永久的な標識をもたらすことを含む。その結果、色素含有親細胞が分裂すると、各娘細胞は親細胞から蛍光の半分を得る。

このプロセスは、その後の分割で継続され、各部門で染料強度が徐々に減少します。所望のエンドポイントでは、各細胞の蛍光強度は、フローサイトメトリーによって測定される。このデータは、細胞が通過した分割の数とパターンを定量化するために使用されます。ここに示すように、蛍光が最も高い細胞集団は親世代由来である。2 番目に高いのは、2 番目の世代に属します。ピークの数によって、セル分割の数が決まります。

加えて、一次免疫細胞を用いれば、例えばT細胞のような特定の細胞集団は、CFSEと共に異なる色蛍光色素で標識することができ、同時に多色フローサイトメトリーを用いて同定することができる。新しいデータを同じグラフにプロットすることができ、異なるCFSE染色強度を有するT細胞サブ集団を示し、それによってT細胞の増殖速度を特異的に分析することができる。このビデオは、抗CD3抗体で刺激されるマウス脾細胞のCFSE染色のためのプロトコルを示しています。これに続いて、T細胞を標識し、細胞増殖を追跡するフローサイトメトリーに染色する。

まず、適切な防護服と実験室用手袋を着用してください。次に、まず洗剤で鉗子を洗い、ハサミを解剖し、次に70%のエタノールで拭き取り、清潔なペーパータオルで拭きます。50ミリリットルのチューブに1ミリリットルのFCSと49ミリリットルのHBSSを組み合わせることで、2%の胎児子牛血清(FCS)濃度のハンクのバランス塩溶液(HBSS)を50ミリリットルを準備します。溶液を約10回上下にゆっくりとピペッティングして混ぜます。次いで、脾臓Bリンパ球のFACS単離に関するビデオプロトコルで実証されているようにマウス脾臓細胞を単離する。

4本の15ミリリットルチューブに1~4本のラベルを付け、7番目の単離された脾臓細胞に10回1回を加えます。次に、各チューブに HBSS 2% FCS の 3 ミリリットルを追加します。次いで、5マイクロモルカルボキシフルオレセインスクハニミジルエステル、またはCFSEの1マイクロリットルを各チューブにピペットする。5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cでチューブを10分間インキュベートします。チューブ1と2の細胞は刺激されません。脾臓CD4およびCD8 T細胞の増殖の基礎レベルを明らかにするために使用されます。

これらのチューブにHBSS 2%FCSのピペット10ミリリットル。チューブ3および4は、細胞周期に及ぼす影響を観察するために抗CD3抗体によって刺激される。HBSS 2% FCSおよび抗CD3抗体の10ミリリットルを、1ミリリットル当たり2.5マイクログラムの最終濃度でチューブ3および4に添加する。次に、すべてのチューブを370 x gで10°Cで7分間遠心分離します。上清を捨てる。HBSS 2% FCSの2ミリリットルでペレットを再ステープルし、得られた溶液を6ウェルプレート上の別々のウェルにピペットします。サンプルのアイデンティティを追跡するために、プレートに1から4まで慎重にラベルを付けます。3日間、摂氏37度、CO25%で細胞をインキュベートします。

3日目に、1と3の管からの細胞を含むべきであるウェル1と3にHBSS 2%FCSの2ミリリットルを追加します。ピペットを上下に激しく上下に動かし、サンプルをラベル付きの5ミリリットルFACSチューブに移します。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。ウェル2と4からのこれらの残りの細胞は、細胞周期に対する刺激の長期的な影響を調査するために5日目に分析されます。10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離し、上清を廃棄します。次に、各チューブに100マイクロリットルの抗体ミックスを追加します。暗闇の中で氷の上で20分間チューブをインキュベートします。次に、各チューブにHBSS 2%FCSの1ミリリットルを追加し、10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。HBSS 2%FCSの200ミリリットルでペレットを再中断し、よく混ぜます。再懸濁ペレットを新しいラベル付きFACSチューブに移します。

次いで、FACSプロトコルに示すようにフローサイトメトリーを用いてT細胞増殖を評価する。細胞をゲートしてリンパ系CD3陽性細胞を選択し、CD4陽性細胞とCD8陽性細胞を区別し、チューブ1と3のデータを記録する。5日目に、6ウェルプレートの残りの2つのウェルからの細胞と細胞染色プロセスを繰り返す。

CD3刺激がCD4およびCD8陽性細胞の細胞周期に及ぼす影響を3日及び5日後に分析する。開始するには、FlowJo アイコンをクリックし、[すべてのサンプル] ウィンドウにファイルをドラッグします。3 日目に収集された非刺激セルのファイルをダブルクリックすると、Y 軸に前方散布を持つドット プロットが表示され、X 軸上に横散布します。ポリゴンをクリックして、その形態に基づいてリンパ球集団を円形にします。サブ集団識別ウィンドウで、母集団リンパ球に名前を付け、[OK] をクリックします。次に、円で囲まれた母集団をダブルクリックし、新しいウィンドウで、Y 軸の Thy1.2 を選択し、X 軸で CD3 を選択します。次に、ポリゴンをクリックして CD3 と Thy1.2 の二重正のセルを丸で囲みます。新しいサブ母集団識別ウィンドウで、母集団に T セルに名前を付け、[OK] をクリックします。次に、円で囲まれた母集団をダブルクリックします。新しいウィンドウで、Y 軸の CD4 を選択し、X 軸で CD8 を選択します。次に、ポリゴンをクリックして CD4 陽性の母集団を丸で囲みます。新しいサブ母集団識別ウィンドウで、母集団 CD4 T セルに名前を付け、[OK] をクリックします。次に、ポリゴンをクリックして CD8 陽性の母集団を丸で囲みます。新しいサブ母集団識別ウィンドウで、母集団 CD8 T セルに名前を付け、[OK] をクリックします。他のファイルと同じ手順を繰り返します。

分割セルと非分割セルの頻度を決定するには、まずレイアウト エディタをクリックしてセルの母集団を視覚化します。次に、CD4 T セルと CD8 T セルを 4 つのチューブのそれぞれから[すべてのサンプル]ウィンドウにドラッグします。母集団を表すグラフが表示されます。チューブごとに、CD8 Tセルのドットプロットをダブルクリックし、グラフ定義の下にあるヒストグラムを選択して結果を視覚化します。パラメータとして CFSE を選択して、各時点で刺激された細胞母集団と非刺激細胞母集団を比較します。非分裂細胞はCFSEの高いレベルを維持するのに対し、増殖細胞はCFSEの含有量を分裂細胞に分割する。

Shift キーを押しながら、ヒストグラムをダブルクリックします。新しいウィンドウで[範囲]をクリックし、最高峰に対応するCFSEの範囲を選択します。サブ母集団識別ウィンドウで、母集団に非分割 CD8 T セルに名前を付け、人口分割 CD8 セルにラベルを付けます。ここで、各チューブ内の分割CD4 T細胞と非分割CD4 T細胞を選択して繰り返します。CD3陽性セルを分割する頻度を調べるには、テーブルエディタをクリックします。次に、対象の母集団をドラッグし、CD8 T細胞を分割し、CD4 T細胞をテーブルに分割します。[統計] メニューで、[T セルの頻度] を選択します。次に、[テーブルの作成] をクリックして、新しいテーブルの頻度を表示します。

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