Overview
מקור: מונירסילבן 1,2,3, פרצ'טתיבו 1,2,3, סופינובולט 4, רחל גולוב1,2,3
יחידה אחת ללימפופוליס, המחלקה לאימונולוגיה, מכון פסטר, פריז, צרפת
2 INSERM U1223, פריז, צרפת
3 100é Paris Diderot, סורבון פריז סיטה, צ'רול פסטר, פריז, צרפת
4 פלטפרום ציטומטריה זרימה, ציטומטריה וסמנים ביולוגיים UtechS, המרכז למדע תרגום, מכון פסטר, פריז, צרפת
העברת תאים מאמצת היא שיטה להכנסת תאים לחולה או לאורגניזם מחקרי על מנת לטפל במחלה או ללמוד תהליך ביולוגי, כגון המטופיס. מטרות ההעברה המאמצת שונות; זה יכול לשמש בביולוגיה בסיסית, כמו גם במדעי הרפואה (1, 2). במודלים של עכבר, העברה והפצה של תאים שהועברו ניתן ללמוד ואחריו מערכת מעקב (סמן משטח תא, כתמים על ידי CFSE, וכו '). במחקרי סרטן על מודלים עכבר, העברה של אוכלוסיות תאים ספציפיות יכולה לשמש כטיפול ניסיוני נגד גידולים. דוגמה נוספת לטכניקה זו היא יצירת עכברים כימריים על ידי העברת תאי מח עצם לעכברים או עכברים מוקרן עם פנוטיפ חיסוני חמור. מודל עכבר זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעה של מחיקת גנים על אוכלוסיית תאים ספציפית למשל. העברת תאי השאלת עצם משמשת גם בטיפול רפואי אנושי. כאשר חולים מוקרנים במקרה של טיפול בסרטן, העברה מאמצת של מח עצם מאפשרת שחזור מערכת החיסון.
הצעד הראשון בטכניקה זו הוא להשיג את אוכלוסיית התאים של עניין. הטכניקה שנבחרה לבודד אוכלוסייה זו תלויה ברמת הספציפיות של האוכלוסייה הממוקדת. רמת הבחירה הגדולה ביותר היא האיבר כולו, שבו נלקחות כל אוכלוסיות התאים הקיימות באיבר. שיטה מדויקת יותר היא בחירה של אוכלוסיית תאי יעד, שנבחרה לעתים קרובות על-ידי סמן משטח תא אחד. השיטה האידיאלית למיין תאים במקרה זה היא על ידי מיון מגנטי. לבסוף, הרמה המחמירה ביותר היא בחירת התאים על ידי מספר סמני פני השטח של התא כדי למיין אוכלוסיות תאים ספציפיות מאוד. מיון ציטומטריית זרימה היא השיטה הפופולרית ביותר עבור רמה זו של בחירה. לאחר קבלת אוכלוסיית העניין, ניתן להעביר אותה למארח. לפני העברה מאמצת זה חיוני כדי להבטיח תאימות בין המארח לתורם. ואכן, ללא קשר למטרת ההעברה, התאימות חיונית כדי להבטיח אימוץ תאים על ידי המארח ללא דחיית תאים.
בתרגיל מעבדה זה, אנו מדגימים את טכניקת העברת התאים המאמצת על ידי העברת טחול מעכבר CD45.2 לעכבר CD45.1 Ragγc (חסר לימפוציטים) וארבעה ימים לאחר מכן מאשרים את העברת הטחול באמצעות ציטומטריית זרימה (ראה איור 1).
איור 1: ייצוג סכמטי של העברה מאמצת. (1) ספלוציטים מבודדים מעכברי CD45.2 ו- (2) מועברים בעכבר CD45.1 Ragγc, עכבר בקרה מוזרק ל- PBS בלבד. (3) 4 ימים לאחר העברה מאמצת, טחול הם התאוששו מעכברים ו (4) מנותח על ידי cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Procedure
1. הכנה
- לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
- לחטא את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן יבש ביסודיות.
- הכן 50 מ"ל מתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה סרום עגל עוברי 2% (FCS).
2. ניתוח
- באמצעות מערכת אספקת פחמן דו חמצני, להרדים את העכבר על ידי היפוקסיה. אבטחו את העכבר המתת חסד על צלחת ניתוח בתנוחת העפרוניזציה ובצעו לפרוסטומיה אורך באמצעות מספריים ומלקחיים.
- באמצעות מלקחיים להזיז את המעיים ואת הבטן בצד ימין של הבטן כדי לחשוף את הבטן ואת הטחול. הטחול מחובר לקיבה.
- באמצעות מלקחיים בזהירות לנתק את הטחול מן הבטן ומניחים אותו על צלחת פטרי המכיל 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.
3. בידוד תאי מערכת החיסון
- מניחים את הטחול על מסננת תא 40 מיקרומטר מעל צלחת פטרי. למחוץ את הטחול עם בוכנה כדי לנתק אותו.
- לשחזר את התאים דבק על ידי שטיפה הבוכנה ואת מסננת עם 1 מ"ל של HBSS 2% FCS.
- מעבירים את הטחול והמנותק לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מיליליטר של HBSS 2% FCS ולהעביר את הנוזל לצינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
- resuspend הכדור ב 2 מ"ל של אשלגן אמוניום כלוריד צינור מעלה ומטה כדי resuspend הכדור ולזר את אריתרוציטים.
- המתן 2 דקות והוסף HBSS 2% FCS לכדור resuspended כדי להשיג את הנפח עד 14 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של HBSS 2% FCS על ידי צנרת למעלה ולמטה.
- ספירת התאים באמצעות בדיקות כתמים כחולות טריפן והתאמת ריכוז התא הסופי ל- 107 תאים/מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.
4. העברה מאמצת
- העברה 2 מ"ל של השעיית תא המתקבלת בצינור איסוף 5 מ"ל.
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS וצנטריפוגה הצינור ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס.
- להשליך כדורי supernatant ו resuspend ב 200 μL של PBS.
- באמצעות מזרק 0.5 מ"ל עם מחט 29G להזריק 200 μL של השעיית תא לתוך העכבר הניסיוני תוך ורידי לתוך סינוס הדם רטרו-מסלולית.
- כמו שליטה, להזריק עכבר שני באותו סינוס דם עם 200 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט.
5. תאים קציר וכתמים
- ארבעה ימים לאחר ההעברה המאמצת, להרדים עכברים ולהסיר את הטחול.
- קוצר את הטחול כמתואר בסעיף 3.
- העבר 100 μL של השעיות תא מכל עכבר לשני צינורות FACS, שכותרתו "שליטה" ו "הועבר".
- צנטריפוגות הצינור ב 370 x g במשך 7 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatants.
- הכן תערובת המכילה את ארבעת הנוגדנים בדילול המפורט בטבלה 1.
| נוגדנים | פלואורוכרום | דילול |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | נגמ"ש7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
טבלה 1: קומפוזיציה לערבב נוגדנים. ארבעה קוקטיילים נוגדנים הכנה באמצעות מצומדים נוגדנים-פלואורסצנטיים מרוכזים ו- HBSS.
- מוסיפים 100 μL של התערובת לכל צינור, ולאחר מכן לדגור במשך 20 דקות על קרח בחושך.
- הוסף 1 מ"ל של HBSS 2%FCS ולאחר מכן צנטריפוגות הצינורות ב 370 x גרם במשך 3 דקות ב 10 °C.
- להשליך את supernatants ו resuspend הכדורים ב 200 μL של HBSS 2% FCS.
- העבר את התאים המותפנים מחדש לצינורות FACS חדשים ומסומנים בתווית.
- באמצעות ציטומטריית זרימה, כפי שמוצג בפרוטוקול FACS, להעריך את נוכחותם של לימפוציטים חיוביים CD45.2.
6. ניתוח נתונים
- פתח את תוכנת "FlowJo" וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון "כל הדוגמה".
- לחץ פעמיים על הקובץ "הועבר" כדי להציג את התאים שנרשמו מאותה דגימה על חלקת נקודות המציגה פיזור קדימה "SSC-A" על ציר Y ופיזור צדדי "FSC-A" על ציר X.
- לחץ על "מצולע" וצור אסטרטגיית הגינג לבחירת לימפוציטים, לאחר מכן הבחין בין תאים תורמים ומארחים באמצעות סמני פני השטח של התא (CD45.1, CD45.2) ולאחר מכן מאפיין את CD45.2+ אוכלוסיית התאים (CD3, CD4).
- חזור על שלבי הניתוח עם קובץ "עכבר הבקרה".
- כדי להציג באופן חזותי אוכלוסיית תאים, לחץ על "עורך הפריסה".
- גרור את "התאים שהועברו" ואת " האוכלוסייה "תאים שהועברו CD4" מ "הועבר" ו "פקד" קבצים אל " הכרטיסיהעורך פריסה".
- תיימת נקודות המייצגת CD45.2+ תאים ולימפוציטים CD4 תופיע.
- תאים שהועברו על - CD45.2 אמורים להופיע רק ב" עכברהמועבר" בתכנון הנקודות .
העברת תאים מאמצת היא שיטה להכנסת תאים מעניינים לאורגניזם. זוהי טכניקה רבת עוצמה ללמוד מנגנונים ביולוגיים שונים, כולל פעולה של סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים. בנוסף, העברה מאמצת היא טיפול חדשני מבטיח עבור תנאים רבים, כגון אלה הדורשים השתלות מח עצם או טיפולים בסרטן שבו תאי T של המטופל עצמו ניתן לחלץ, לשנות לזהות ולהרוס את התאים הסרטניים, ולאחר מכן חזר לגוף להילחם בגידולים.
במעבדה, מודלים של בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקר העברה מאמצת. לדוגמה, עכברי נוקאאוט גמא-C של CD45.1 Rag חסרים קולטנים בסיסיים עבור ציטוקינים רבים, החיוניים לבידול תקין של תאי גזע המטופויים ללימפוציטים. כתוצאה מכך, לעכברי הנוקאאוט יש התפתחות לימפוציטים פגועה ואין להם רוצח טבעי, או NK, תאים, תאי T או תאי B.
העברה מאמצת יכולה לשמש כדי להכניס את תאי החיסון החסרים לעכברים אלה שנפרצו, על ידי קצירת רקמת עכבר תורם תחילה המכילה ריכוזים גבוהים של תאי מערכת החיסון, כגון הטחול. לאחר מכן הרקמה מנותקת ומגוון תאי טחול, כולל תאי החיסון, מבודדים. לאחר מכן, אריתרוציטים לא רצויים, או תאי דם אדומים, ניתן לתבל באמצעות תוספת של אמוניום כלוריד אשלגן ליסינג חוצץ ואת תאי הדם הלבנים הנותרים, או טחול, מופרדים לאחר מכן מן פסולת התא באמצעות צנטריפוגה.
לבסוף, הטחול המטוהר מוזרק לעכברים האימונו-קום, מה שמקל על מחקרים מפורטים על תפקודי התאים האלה. מספר ימים לאחר מכן, ההצלחה של העברת תאי החיסון המאמצת יכולה להיות מאושרת על ידי בידוד תחילה והכנת splenoncytes המארח באותו אופן כמו רקמת התורם. לאחר מכן, תאים אלה מוכתמים באמצעות נוגדנים מסומנים נגד סמני תאי החיסון התורמים, כך שניתן לאמת אותם ולמיין אותם באמצעות FACS.
ראשית, לבשו כפפות מעבדה וציוד מגן מתאים. לאחר מכן, לשטוף זוג מלקחיים ניתוח מספריים תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן לייבש אותם עם מגבת נייר נקי. הכן 50 מיליליטר של פתרון מלח מאוזן של האנק, או HBSS, עם סרום עגל עוברי 2%, או FCS, על ידי שילוב מיליליטר אחד של FCS עם 49 מיליליטר של HBSS בצינור 50 מיליליטר. מערבבים על ידי צנרת עדינה של התמיסה למעלה ולמטה בערך 10 פעמים.
לנתח את העכבר המתת חסד ולהסיר הטחול שלה כפי שהודגם בטכנולוגיית FACS פרוטוקול וידאו JoVE עבור הפרדת לימפוציטים בטחול B. כדי לבודד את תאי מערכת החיסון, מניחים תחילה את הטחול על מסננת תאי 40 מיקרומטר בצלחת פטרי. מרסקים את הטחול עם בוכנה כדי לנתק אותו לצלחת. לשחזר את התאים דבק על ידי שטיפה הבוכנה ואת מסננת עם 1 מיליליטר של HBSS 2% FCS. לאחר מכן, pipette הטחול מנותק ונוזל מצלחת פטרי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מיליליטר של HBSS 2% FCS ולהעביר את הנוזל לצינור 15 מיליליטר.
צנטריפוגות הצינור ב 370 פעמים g במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לאחזר את הצינור בזהירות כדי לא להפריע לכדור. עכשיו, להסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור ולהשליך את הנוזל במיכל פסולת מתאים. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של אמוניום כלוריד אשלגן ליסינג חוצץ צינור צנטריפוגה פיפטה למעלה ולמטה כדי resuspend הכדור ולזלזול את אריתרוציטים. המתן שתי דקות ולאחר מכן הוסף HBSS 2% FCS לכדור resuspended כדי לקבל ערך כולל של 14 מיליליטר. חזור על צנטריפוגה. לאחזר את הצינור בזהירות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, resuspend הכדור ב 5 מיליליטר HBSS 2% FCS על ידי צנרת למעלה ולמטה. לאחר מכן, לספור את התאים בהשעיה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של כחול טריפן לחמישה מיקרוליטרים של השעיית תאים ומערבבים היטב על ידי צנרת. לאחר מכן, הפקד בעדינות טיפה של חמישה מיקרוליטרים של השעיית תאים מדוללים בין זכוכית הכיסוי למגלשת Malassez. כאשר המיקרוסקופ מוגדר להגדלה של פי 40, ספר את מספר התאים. התאם את ריכוז התאים ל- 10 לשבעת התאים למיליליטר על-ידי הוספת הנפח המתאים של HBSS 2% FCS.
כדי להתחיל את ההעברה המאמצת, להעביר שני מיליליטר של השעיית התא לצינור איסוף חמישה מיליליטר. צנטריפוגות הצינור ב 370 פעמים גרם במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatant. לאחר מכן, resuspend הכדור בשני מיליליטר של תמיסת מלח חוצץ פוספט וצנטריפוגה הצינור ב 370 פעמים g במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס. זרוק את סופר-טבעי. לאחר מכן, resuspend הכדור ב 200 microliters של תמיסת מלח חוצץ פוספט. באמצעות מזרק 0.5 מיליליטר עם מחט 29-מד, להזריק 200 microliters של השעיית התא לתוך העכבר הניסיוני תוך ורידי לתוך סינוס הדם רטרו-מסלולית.
ארבעה ימים לאחר ההעברה המאמצת, המת תנשמו את העכברים והסירו את הטחול. לאחר מכן, לקצור את תאי החיסון כמתואר בסעיף שלוש. לאחר מכן, העבר 100 מיקרוליטרים של השעיית תא מכל עכבר לשני צינורות FACS המסומנים בשליטה ומועברים. צנטריפוגות הצינורות ב 370 פעמים גרם במשך שבע דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשליך את supernatants. עכשיו, להכין תערובת המכילה את ארבעת הנוגדנים בדילול המפורט בטבלה אחת. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של התערובת לכל צינור ולאחר מכן לדגור במשך 20 דקות על קרח בחושך. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של HBSS 2% FCS לכל צינור ולאחר מכן צנטריפוגה הצינורות ב 370 פעמים g במשך שלוש דקות ב 10 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatants ולאחר מכן resuspend הכדורים ב 200 microliters של HBSS 2% FCS. העבר את התאים המותבים מחדש לצינורות FACS חדשים בעלי תווית. כעת, השתמש בציטומטריית זרימה כפי שמוצג בפרוטוקול FACS כדי להעריך את נוכחותו של CD45. שני לימפוציטים חיוביים.
כעת, נקבע את הנוכחות CD45.2 לימפוציטים שהיו מבודדים מה-CD45. טחול מארח אחד. כדי להתחיל, לחץ פעמיים על סמל FlowJo וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון לדוגמה. לאחר מכן, לחץ פעמיים על הקובץ שהועבר כדי להציג את התאים שנרשמו מאותה דגימה ב- plot dot המציגה FSCA פיזור קדימה בציר x ופיזור צד SSCA בציר ה- y. לחץ על מצולע כדי להקיף את אוכלוסיות הלימפוציטים. מופיע חלון זיהוי חדש של אכלוס משנה. לחץ על אישור. כעת, הגדר את ציר ה- y ל- FSC-W ואת ציר ה- x ל- FSC-A. בחר את אוכלוסיית התא הבודד בעזרת הכלי מצולע כפי שהודגם בעבר.
לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש עבור התאים שנבחרו. בחלון החדש, בחר CD45.2 ב- Y וב- CD45.1 ב- X. לחץ על סמל T והתאם אישית את הציר כדי להגדיל את התוויה. לאחר מכן, לחץ על מצולע כדי להקיף את התאים החיוביים CD45.2. בחלון הזיהוי של אוכלוסין, תן שם לתאים שהועברו על ידי אוכלוסיית התאים ולחץ על אישור. באותו חלון, לחץ על מלבן כדי לבחור את התאים השליליים CD45.2. בחלון זיהוי אוכלוסין, תן שם לתאי מארח אוכלוסית התאים ולחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה CD45.2, האוכלוסייה המועברת, כדי ליצור חלון חדש עבור התאים שנבחרו. בחלון החדש, בחר CD3 ב- Y וב- CD4 ב- X.
לאחר מכן, לחץ על מצולע כדי להקיף את התאים החיוביים CD4 CD3. בחלון זיהוי זו של אוכלוסיות משנה, תן שם לאוכלוסיית התאים שהועברה לתאי CD4. לאחר מכן, חזור על שלבי הניתוח הקודמים עם קובץ עכבר הבקרה. לבסוף, כדי להציג באופן חזותי את אוכלוסיות התאים שלך, לחץ על עורך הפריסה. גרור את התאים שהועברו ואת אוכלוסיית תאי CD4 שהועברו מקבצים שהועברו ושליטה בכרטיסיה עורך פריסה. תיימת נקודות המייצגת תאים חיוביים CD45.2 ולימפוציטים CD4 תופיע. CD45. 2 תאים שהועברו אמורים להופיע רק בתכנון הנקודות של העכבר שהועבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
לעכברי ראג'ק יש הרכב שונה של מערכת החיסון, בעיקר חסר לימפוציטים. העברה מאמצת של טחול מאפשרת הכנסת אוכלוסייה חסרה כגון תאי T ו- B. הכתמים שלנו כללו סמני משטח תא CD45.1 ו- CD45.2 כדי להבחין בין תאים מארחים ותורם בהתאמה (איור 2A). הוא כלל גם סמן אחר של פני התא כדי להדגיש אוכלוסיות תאים הנעדרות מעכברי ראג'ק, כגון תאי CD4 T(איור 2B). כצפוי, לעכבר הבקרה לא היו תאים חיוביים ל- CD45.2(איור 2B,חלוניות עליונות) והעכבר המועבר עשה זאת (איור 2B, חלוניות תחתונות, 71.2% מכלל התאים). אנו יכולים גם לזהות באופן ספציפי תאי CD4 T בתוך תאים שהועברו (22.1% מתאי CD45.2).
איור 2: תוצאות מייצגות של העברה מאמצת. (א) היסטוגרמה של תאי CD45.2 מעכברים שהוזרקו עם PBS (קבוצת ביקורת) (מקווקו) ועכברים מוזרקים עם טחול CD45.2 (קבוצת בדיקה) (קו מוצק). (B) אסטרטגיית גיטינג של CD45.2 תאים חיוביים בעכברים בקרה מוזרק עם PBS (לוחות עליונים) ועכברים מוזרק CD45.2 טחול (לוחות תחתון). תאים תורמים ומארחים נבדלים באמצעות סמני פני השטח של התא (CD45.1, CD45.2), ואז מאופיינים אוכלוסיית תאים חיוביים CD45.2 (CD3, CD4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
העברה מאמצת היא טכניקה תרגומית בתחומי מדע שונים, עם יישומים ברפואה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד נדידת תאים וטרופיזם או שכיחות של מחסור בחלבון באוכלוסיות תאים ספציפיות. במקרה האחרון, ניתן להשתמש בטכנולוגיות שונות, במיוחד עכברי GMO שבהם אוכלוסיות תאים ספציפיות חסרות באופן מהותי. עם זאת, בנייה גנטית כדי להשיג עכברים מהונדסים גנטית יכולה להיות תהליך מורכב וארוך מאוד. במקרה זה, העברה מאמצת של אוכלוסיית תאים לקויה קלה ומהירה יותר.
העברות אימוץ יש יישומים ישירים ברפואה. לדוגמה, שתלי מח עצם בחולים מוקרנים במהלך טיפול בסרטן משמשים לשחזור המערכת החיסונית. לאחרונה נעשה שימוש ביישומים אחרים של העברה מאמצת בתחום הרפואי. תאי T מלאכותיים (הנקראים תא T CAR) נועדו לזהות ולחסל כמה סוגי סרטן. בנוסף, תאים מהונדסים אלה בנויים כדי לדכא את סיכון הדחייה על ידי המארח. העברת תאי CAR T נבדקת כעת בניסויים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Restifo, N. P., Dudley, M. E. and Rosenberg., S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nature reviews. Immunology, 12 (4): 269-281, (2012).
- Bonini, C., and Mondino, A. Adoptive T-cell therapy for cancer: The era of engineered T cells. European journal of immunology, 45 (9): 2457-69, (2015).
