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收养细胞转移:将供体小鼠孢子细胞引入宿主小鼠,并通过FACS评估成功
 

收养细胞转移:将供体小鼠孢子细胞引入宿主小鼠,并通过FACS评估成功

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采用细胞转移是一种将感兴趣的细胞引入生物体的方法。它是研究各种生物机制的有力技术,包括免疫细胞特定类别的作用。此外,收养转移是一种有前途的新疗法,适用于许多疾病,例如那些需要骨髓移植或癌症治疗的患者自己的T细胞可以提取,改变,以识别和摧毁癌细胞,以及然后回到身体来对抗肿瘤。

在实验室里,动物模型经常被用来研究收养转移。例如,CD45.1 Rag Gamma-c 敲除小鼠缺乏许多细胞因子的基本受体,这是造血干细胞正常分化为淋巴细胞所必需的。因此,敲除小鼠的淋巴细胞发育受损,没有自然杀伤剂,或NK,细胞,T细胞,或B细胞。

通过首先收获含有高浓度免疫细胞(如脾脏)的供体小鼠组织,收养转移可用于将缺失的免疫细胞引入这些受损的小鼠体内。然后组织分离,各种脾细胞,包括免疫细胞,被分离。其次,不需要的红细胞,或红血球,可以通过添加氯化铵钾解毒缓冲液进行解液,剩余的白细胞,或血细胞,然后使用离心从细胞碎片中分离出来。

最后,将纯化的小鼠注射到免疫功能低下小鼠中,促进对这些细胞功能的详细研究。几天后,通过首先以与供体组织相同的方式分离和制备宿主脾细胞,可以确认收养免疫细胞转移的成功。然后,这些细胞使用标记抗体对供体免疫细胞标记进行染色,以便使用 FACS 验证和分类它们。

首先,戴上实验室手套和适当的防护设备。接下来,先用洗涤剂洗一把钳子,然后用70%的乙醇清洗剪刀,然后用干净的纸巾擦干。将一毫升FCS与49毫升的HBSS在50毫升管中结合,用2%的胎儿小牛血清(FCS)制备50毫升汉克平衡盐溶液(HBSS)。通过轻轻上下移液约10次混合。

解剖小鼠并切除其脾脏,如用于脾B淋巴细胞分离的JoVE视频协议FACS技术所示。要分离免疫细胞,首先将脾脏放在培养皿中的40微米细胞过滤器上。用柱塞压碎脾脏,将其分离到盘子里。用 1 毫升的 HBSS 2% FCS 对柱塞和滤网进行冲剂,以恢复粘附细胞。然后,将分离的脾脏和液体从培养皿移入50毫升的离心管中。用 5 毫升的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿,并将液体转移到 15 毫升管中。

在 370 次 g 下在 10 摄氏度下将管离心 7 分钟,然后小心取回管,以免干扰颗粒。现在,在不干扰颗粒的情况下去除上清液,并将液体丢弃在适当的废物容器中。然后,在离心管中加入两毫升氯化铵酸钾解毒缓冲液,上下移液器重新悬浮颗粒并赖解红细胞。等待两分钟,然后将 HBSS 2% FCS 添加到悬浮颗粒中,以获得 14 毫升的总价值。重复离心。小心取回管子并丢弃上清液。然后,通过上下移液,将颗粒重新悬浮在 5 毫升 HBSS 2% FCS 中。接下来,计算悬浮细胞的数量。将五微升的试青加入五微升的细胞悬浮液,并通过移液很好地混合。然后,轻轻地在盖玻璃和马拉塞兹幻灯片之间沉积五微升的稀释细胞悬浮液。将显微镜设置为 40 倍放大倍率时,计算细胞数。通过添加适当的HBSS 2%FCS,将细胞浓度调整到每毫升10至7个细胞。

要开始收养转移,将两毫升的细胞悬浮液转移到五毫升收集管。在370次g下在10摄氏度下将管子离心7分钟,然后丢弃上清液。接下来,将颗粒重新悬浮在两毫升磷酸盐缓冲盐水中,并在10摄氏度的温度下将管在370次g下离心7分钟。丢弃上清液。然后,在200微升磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮颗粒。使用带有29口径针头的0.5毫升注射器,将200微升的细胞悬浮液静脉注射到实验小鼠的逆轨血坏液中。

收养转移四天后,对小鼠实施安乐死并切除脾脏。然后,如第三节所述,收获免疫细胞。接下来,将每只小鼠的100微升细胞悬浮液转移到两个贴有控制标签的FACS管中并转移。在370次g下在10摄氏度下将管子离心7分钟,然后丢弃上生子。现在,在表一所列稀释剂处准备一个含有四种抗体的混合物。将100微升的混合物加入每根管子,然后在黑暗中在冰上孵育20分钟。接下来,在每个管中加入一毫升HBSS 2%FCS,然后在10摄氏度的温度下以370次g将管离心3分钟。丢弃上生子,然后在 200 微升的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。将重新悬浮的细胞转移到新的标记的 FACS 管中。现在,使用 FACS 协议中所示的流式细胞测定法来评估 CD45 的存在。2阳性淋巴细胞。

现在,我们将确定从 CD45 中分离出的 CD45.2 淋巴细胞的存在。1 主脾脏。要开始,双击 FlowJo 图标,并拖动所有示例窗口中每个管的文件。然后,双击传输的文件,在点图上显示从该样本记录的单元格,该点图在 x 轴上显示向前散射 FSCA,在 y 轴上显示侧散射 SSCA。单击多边形以圈出淋巴细胞群。将显示一个新的子填充标识窗口。单击"确定"。现在,将 y 轴设置为 FSC-W,将 x 轴设置为 FSC-A。选择使用多边形工具的单个单元格填充,如前面所示。

接下来,双击圈填充,为所选单元格创建一个新窗口。在新窗口中,在 X 上的 Y 和 CD45.1 上选择 CD45.2。单击 T 图标并自定义轴以放大绘图。接下来,单击多边形以圈出 CD45.2 正细胞。在子填充标识窗口中,命名单元格群转移的单元格,然后单击"确定"。在同一窗口中,单击矩形以选择 CD45.2 负单元格。在子填充标识窗口中,命名单元格填充宿主单元格,然后单击"确定"。接下来,双击 CD45.2 圈填充、转移总体,为所选单元格创建一个新窗口。在新窗口中,选择 X 上的 Y 和 CD4 上的 CD3。

接下来,单击多边形以圈出 CD4 CD3 阳性细胞。在此子填充标识窗口中,命名已转移的细胞群 CD4 细胞。然后,使用控制鼠标文件重复前面的分析步骤。最后,要可视化单元格群,请单击布局编辑器。将传输的单元格和传输的 CD4 单元格从传输和控制文件拖动到布局编辑器选项卡中。将显示一个点图,表示 CD45.2 阳性细胞和 CD4 淋巴细胞。CD45.2 传输的单元格应仅出现在传输的鼠标点图中。

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