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Adoptivzelltransfer: Spendermaus-Splenozyten einer Host-Maus einführen und Erfolg über FACS bewerten

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Der Adoptivzelltransfer ist eine Methode zur Einführung von Interessenszellen in einen Organismus. Es ist eine leistungsfähige Technik, um verschiedene biologische Mechanismen zu studieren, einschließlich der Wirkung bestimmter Klassen von Immunzellen. Darüber hinaus ist der Adoptivtransfer eine vielversprechende neuartige Behandlung für zahlreiche Erkrankungen, wie z. B. solche, die Knochenmarktransplantationen oder Krebsbehandlungen erfordern, bei denen die eigenen T-Zellen eines Patienten extrahiert, verändert werden können, um die Krebszellen zu erkennen und zu zerstören, und dann zum Körper zurückgekehrt, um Tumore zu bekämpfen.

Im Labor werden Tiermodelle häufig verwendet, um Den Adoptivtransfer zu untersuchen. Zum Beispiel fehlt es CD45.1 Rag gamma-c Knockout-Mäusen an fundamentalen Rezeptoren für viele Zytokine, die für die normale Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen in Lymphozyten unerlässlich sind. Infolgedessen haben die Knockout-Mäuse eine beeinträchtigte Lymphozytenentwicklung und haben keinen natürlichen Killer, oder NK, Zellen, T-Zellen oder B-Zellen.

Der Adoptivtransfer kann verwendet werden, um die fehlenden Immunzellen in diese kompromittierten Mäuse einzuführen, indem zuerst Spendermausgewebe geerntet wird, das hohe Konzentrationen von Immunzellen wie der Milz enthält. Das Gewebe wird dann dissoziiert und eine Vielzahl von Milzzellen, einschließlich der Immunzellen, werden isoliert. Als nächstes können unerwünschte Erythrozyten oder rote Blutkörperchen über die Zugabe von Ammoniumchlorid-Kaliumlysingpufferlysiert werden und die verbleibenden weißen Blutkörperchen oder Splenozyten werden dann mittels Zentrifugation vom Zellmüll getrennt.

Schließlich werden die gereinigten Splenozyten in die immungeschwächten Mäuse injiziert, was detaillierte Studien der Funktionen dieser Zellen ermöglicht. Einige Tage später kann der Erfolg des Adoptivimmunzelltransfers durch erste Isolierung und Vorbereitung der Wirtsssel in der gleichen Weise wie das Spendergewebe bestätigt werden. Dann werden diese Zellen mit markierten Antikörpern gegen die Spender-Immunzellmarker gefärbt, so dass sie mit FACS verifiziert und sortiert werden können.

Zunächst laborhandschuhe und die entsprechende Schutzausrüstung anziehen. Als nächstes waschen Sie ein Paar Zangen und sezieren Schere zuerst mit einem Waschmittel und dann mit 70% Ethanol und dann trocknen Sie sie mit einem sauberen Papiertuch. Bereiten Sie 50 Milliliter von Hanks Balanced Salt Solution, oder HBSS, mit 2% Fetal Calf Serum, oder FCS, vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einem 50-Milliliter-Rohr kombinieren. Mischen Sie die Lösung etwa 10 Mal, indem Sie die Lösung sanft nach oben und unten pfeifen.

Sezieren Sie die eingeschläferte Maus und entfernen Sie ihre Milz, wie im JoVE-Videoprotokoll FACS-Technologie für die Splenic B Lymphozyten-Trennung gezeigt. Um Immunzellen zu isolieren, legen Sie zuerst die Milz auf ein 40 Mikrometer Zellsieb in einer Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es in die Schale zu dissoziieren. Stellen Sie die haftenden Zellen wieder her, indem Sie den Kolben und das Sieb mit 1 Milliliter HBSS 2% FCS spülen. Dann pipette die dissoziierte Milz und Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Waschen Sie die Petrischale mit 5 Milliliter HBSS 2% FCS und übertragen Sie die Flüssigkeit in das 15 Milliliter Rohr.

Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und holen Sie das Rohr dann vorsichtig ab, um das Pellet nicht zu stören. Entfernen Sie nun den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem geeigneten Abfallbehälter. Dann fügen Sie zwei Milliliter Ammoniumchlorid Kaliumlysing Puffer in das Zentrifugenrohr und Pipette nach oben und unten, um das Pellet wieder aufzuhängen und die Erythrozyten zu lyse. Warten Sie zwei Minuten und fügen Sie dann HBSS 2% FCS zum resuspendierten Pellet hinzu, um einen Gesamtwert von 14 Millilitern zu erhalten. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Holen Sie sich das Rohr sorgfältig und entsorgen Sie den Überstand. Dann, resuspendieren Sie das Pellet in 5 Milliliter HBSS 2% FCS durch Pipettieren nach oben und unten. Zählen Sie als Nächstes die Zellen in suspension. Fügen Sie fünf Mikroliter Trypan blau zu fünf Mikroliter Zellsuspension hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren. Dann legen Sie vorsichtig einen fünf Mikroliter Tropfen verdünnte Zellsuspension zwischen dem Deckglas und der Malassez-Rutsche ab. Wenn das Mikroskop auf 40-fache Vergrößerung eingestellt ist, zählen Sie die Anzahl der Zellen. Passen Sie die Zellkonzentration auf 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter an, indem Sie das entsprechende Volumen von HBSS 2% FCS hinzufügen.

Um die Adoptivübertragung zu beginnen, übertragen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Sammelrohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und entsorgen Sie dann den Überstand. Als nächstes setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter Phosphat gepufferte Saline und Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand. Dann setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter Phosphat gepufferte Saline wieder aus. Mit einer 0,5-Milliliter-Spritze mit einer 29-Spur-Nadel injizieren Sie 200 Mikroliter Zellsuspension in die experimentelle Maus intravenös in den retroorbitalen Blutsinus.

Vier Tage nach dem Adoptivtransfer die Mäuse einschläfern und die Milz entfernen. Dann ernten Sie die Immunzellen, wie in Abschnitt drei beschrieben. Als nächstes übertragen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension von jeder Maus in zwei FACS-Röhren, die mit der Steuerung beschriftet sind, und übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und entsorgen Sie dann die Überräube. Bereiten Sie nun eine Mischung mit den vier Antikörpern an der in Tabelle eins aufgeführten Verdünnung vor. Fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung in jede Röhre und dann für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter HBSS 2% FCS zu jedem Rohr hinzu und zentrifugieren Sie die Rohre dann bei 370 mal g für drei Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die Pellets in 200 Mikroliter HBSS 2% FCS wieder aus. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in neue markierte FACS-Rohre. Verwenden Sie nun die Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt, um das Vorhandensein von CD45 zu bewerten. 2 positive Lymphozyten.

Nun werden wir das Vorhandensein von CD45.2-Lymphozyten bestimmen, die von der CD45 isoliert wurden. 1 Host Milz. Um zu starten, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im gesamten Beispielfenster. Doppelklicken Sie dann auf die übertragene Datei, um die zellen, die von dieser Probe aufgezeichnet wurden, auf einem Punktdiagramm anzuzeigen, das Vorwärtsstreu-FSCA auf der x-Achse und DieSeitenstreuung SSCA auf der y-Achse anzeigt. Klicken Sie auf Polygon, um die Lymphozytenpopulationen zu umkreisen. Ein neues Subpopulations-Identifikationsfenster wird angezeigt. Klicken Sie auf OK. Legen Sie nun die y-Achse auf FSC-W und die x-Achse auf FSC-A fest. Wählen Sie die Einzelzellenpopulation mit dem Polygonwerkzeug aus, wie zuvor gezeigt.

Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit, um ein neues Fenster für die ausgewählten Zellen zu erstellen. Wählen Sie im neuen Fenster CD45.2 auf dem Y und CD45.1 auf dem X. Klicken Sie auf das T-Symbol und passen Sie die Achse an, um das Diagramm zu vergrößern. Klicken Sie als Nächstes auf Polygon, um die CD45.2-positiven Zellen zu umkreisen. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Subpopulation die übertragenen Zellen der Zellen, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im selben Fenster auf Rechteck, um die negativen CD45.2-Zellen auszuwählen. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Subpopulation die Hostzellen der Zellenauffüllung, und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die cd45.2-Kreispopulation, die überübertragene Grundgesamtheit, um ein neues Fenster für die ausgewählten Zellen zu erstellen. Wählen Sie im neuen Fenster CD3 auf dem Y und CD4 auf dem X aus.

Klicken Sie als Nächstes auf Polygon, um die CD4 CD3-positiven Zellen zu umkreisen. Benennen Sie in diesem Anzeigefenster zur Identifizierung der Teilpopulation die übertragenen CD4-Zellen der Zellen. Wiederholen Sie dann die vorherigen Analyseschritte mit der Steuermausdatei. Um Ihre Zellenpopulationen zu visualisieren, klicken Sie schließlich auf Layout-Editor. Ziehen Sie die übertragenen Zellen und die übertragene CD4-Zellenpopulation aus übertragenen und steueren Sie Dateien auf die Registerkarte Layout-Editor. Es wird ein Punktdiagramm angezeigt, das CD45.2-positive Zellen und CD4-Lymphozyten darstellt. CD45. 2 übertragene Zellen sollten nur im übertragenen Mauspunktdiagramm angezeigt werden.

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