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Transferência celular adotiva: introduzindo esplenócitos de rato doador a um mouse host e avaliando o sucesso via FACS

Overview

Fonte: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unidade de Linfopose, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
2 INSERM U1223, Paris, França
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França

A transferência de células adotivas é um método para introduzir células em um paciente ou organismo de estudo, a fim de tratar uma doença ou estudar um processo biológico, como a hematose. Os objetivos da transferência adotiva são diversos; pode ser usado em biologia fundamental, bem como em ciências médicas (1, 2). Nos modelos de camundongos, a migração e distribuição de células transferidas pode ser estudada e seguida por um sistema de rastreamento (marcador de superfície celular, coloração por CFSE, etc.). Em estudos sobre câncer em modelos de camundongos, a transferência de populações celulares específicas pode ser usada como tratamento experimental contra tumores. Outro exemplo para esta técnica é a criação de camundongos quiméricos por transferência de células de medula óssea para camundongos irradiados ou camundongos com um fenótipo de imunodeficiência grave. Este modelo de mouse pode ser usado para avaliar o impacto da exclusão genética em uma população celular específica, por exemplo. A transferência de células emprestadas ósseas também é usada no tratamento médico humano. Quando os pacientes são irradiados em caso de terapia contra o câncer, a transferência adotiva da medula óssea permite a reconstituição do sistema imunológico.

O primeiro passo dessa técnica é obter a população celular de interesse. A técnica escolhida para isolar essa população depende do nível de especificidade da população-alvo. O maior nível de seleção é todo o órgão, no qual todas as populações celulares presentes no órgão são tomadas. Um método mais preciso é a seleção de uma população celular alvo, muitas vezes selecionada por um marcador de superfície celular. O método ideal para classificar as células neste caso é por classificação magnética. Finalmente, o nível mais rigoroso é a seleção de células por vários marcadores de superfície celular para classificar populações celulares muito específicas. A classificação da citometria de fluxo é o método mais popular para este nível de seleção. Uma vez que a população de interesse é obtida, ela pode ser transferida para o hospedeiro. Antes da transferência adotiva é essencial garantir a compatibilidade entre o hospedeiro e o doador. De fato, independentemente do objetivo de transferência, a compatibilidade é crucial para garantir a adoção de células pelo hospedeiro sem rejeição celular.

Neste exercício de laboratório, demonstramos a técnica de transferência celular adotiva transferindo esplenócitos de um rato CD45.2 para um rato RAGΓC CD45.1 (sem linfócitos) e quatro dias depois confirmamos a transferência de esplenócitos usando citometria de fluxo (ver Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática da transferência adotiva. (1) Os esplenócitos são isolados de camundongos CD45.2 e (2) transferidos em mouse CD45.1 Ragγc, o mouse de controle é injetado apenas com PBS. (3) 4 dias após a transferência adotiva, os esplenócitos são recuperados de camundongos e (4) analisados por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Procedure

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1. Preparação

  1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
  2. Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque bem.
  3. Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

  1. Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
  2. O uso de fórceps move os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
  3. Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

  1. Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
  2. Recupere as células aderidas enxaguando o êmbolo e o coador com 1 mL de HBSS 2% FCS.
  3. Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
  4. Lave a placa de Petri com 5 mililitros de HBSS 2% FCS e transfira o fluido para o tubo de 15 mL.
  5. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
  6. Resuspenque a pelota em 2 mL de cloreto de amônio de potássio para cima e para baixo para resuspensar a pelota e lise os eritrócitos.
  7. Aguarde 2 min e adicione HBSS 2% FCS à pelota resuspended para obter o volume de até 14 mL.
  8. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS por pipetar para cima e para baixo.
  9. Conte as células usando o ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração final da célula para 107 células/mL usando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Transferência Adotiva

  1. Transfira 2 mL de suspensão celular obtida em um tubo de coleta de 5 mL.
  2. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e, em seguida, descartar o supernasal.
  3. Resuspenda a pelota em 2 mL de PBS e centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C.
  4. Descarte a supernasce e a pelota resuspend em 200 μL de PBS.
  5. Usando uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 29G injete 200 μL de suspensão celular no camundongo experimental intravenosamente no seio sanguíneo retro-orbital.
  6. Como controle, injete um segundo rato no mesmo seio sanguíneo com 200 μL de soro fisco tamponado.

5. Colheita e Coloração de Células

  1. Quatro dias após a transferência adotiva, eutanásia ratos e remover o baço.
  2. Colher os esplenócitos como descrito na seção 3.
  3. Transfira 100 μL de suspensões celulares de cada mouse para dois tubos FACS, rotulados como "controle" e "transferidos".
  4. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e, em seguida, descartar os sobrenantes.
  5. Prepare uma mistura contendo os quatro anticorpos nas diluições listadas na Tabela 1.
Anticorpos Fluorochrome Diluição
CD45.1 BV711 1/200
CD45.2 APCCy7 1/400
CD4 BV786 1/1600
CD3 BV421 1/200

Tabela 1: Mistura de anticorpos. Preparação de quatro coquetéis anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.

  1. Adicione 100 μL da mistura a cada tubo e, em seguida, incubar por 20 minutos no gelo no escuro.
  2. Adicione 1 mL de HBSS 2%FCS e, em seguida, centrifugar os tubos a 370 x g por 3 min a 10°C.
  3. Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas em 200 μL de HBSS 2% FCS.
  4. Transfira as células resuspendadas para tubos FACS novos e rotulados.
  5. Utilizando citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS, avaliar a presença de linfócitos positivos CD45.2.

6. Análise de dados

  1. Abra o software "FlowJo" e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All sample".
  2. Clique duas vezes no arquivo "transferido" para exibir as células gravadas a partir dessa amostra em um gráfico de ponto que exibe a dispersão para a frente "SSC-A" no eixo Y e dispersão lateral "FSC-A" no eixo X.
  3. Clique em "polígono" e crie uma estratégia de gating para selecionar linfócitos, em seguida, distinguir células doadoras e hospedeiras usando marcadores de superfície celular (CD45.1, CD45.2), e então caracterizar CD45.2+ população celular (CD3, CD4).
  4. Repita as etapas de análise com o arquivo "mouse de controle".
  5. Para visualizar uma população celular, clique em "Editor de layout".
  6. Arraste as "células transferidas" e as "células CD4" transferidas " população de "transferido" e "controle" arquivos para a "guia Layout Editor".
  7. Um gráfico de pontos representando células CD45.2+ e linfócitos CD4 aparecerá.
  8. As células transferidas CD45.2 só devem aparecer no gráfico de pontos "mouse transferido".

Transferência de células adotivas é um método para introduzir células de interesse em um organismo. É uma técnica poderosa para estudar vários mecanismos biológicos, incluindo a ação de classes específicas de células imunes. Além disso, a transferência adotiva é um tratamento promissor para inúmeras condições, como aquelas que necessitam de transplantes de medula óssea ou tratamentos de câncer onde as próprias células T de um paciente podem ser extraídas, alteradas para reconhecer e destruir as células cancerosas, e depois devolvidas ao corpo para combater tumores.

No laboratório, modelos animais são frequentemente usados para estudar transferência adotiva. Por exemplo, os camundongos de nocaute de origem gamma-c de rag não possuem receptores fundamentais para muitas citocinas, que são essenciais para a diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas em linfócitos. Como resultado, os camundongos eliminatórios têm um desenvolvimento de linfócitos comprometidos e não têm assassino natural, ou NK, células, células T ou células B.

A transferência adotiva pode ser usada para introduzir as células imunes desaparecidas nesses camundongos comprometidos, colhendo primeiro tecido de rato doador contendo altas concentrações de células imunes, como o baço. O tecido é então dissociado e uma variedade de células de baço, incluindo as células imunes, são isoladas. Em seguida, os eritrócitos indesejados, ou glóbulos vermelhos, podem ser liociados através da adição de tampão de potássio de cloreto de amônio e os glóbulos brancos restantes, ou esplenócitos, são então separados dos detritos celulares usando centrifugação.

Finalmente, os esplenócitos purificados são injetados nos camundongos imunocomprometidos, facilitando estudos detalhados das funções dessas células. Vários dias depois, o sucesso da transferência de células imunes adotivas pode ser confirmado primeiro isolando e preparando os espógenos hospedeiros da mesma forma que o tecido doador. Em seguida, essas células são manchadas usando anticorpos rotulados contra os marcadores de células imunes doadora para que possam ser verificadas e classificadas usando FACS.

Para começar, coloque luvas de laboratório e os equipamentos de proteção adequados. Em seguida, lave um par de fórceps e dissecando uma tesoura primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque-os com uma toalha de papel limpa. Prepare 50 mililitros da Solução de Sal Balanceado da Hank, ou HBSS, com soro de bezerro fetal de 2%, ou FCS, combinando um mililitro de FCS com 49 mililitros de HBSS em um tubo de 50 mililitros. Misture suavemente a solução para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.

Dissecar o mouse eutanizado e remover seu baço como demonstrado no protocolo de vídeo JoVE TECNOLOGIA FACS para separação de linfócitos B esplênicos. Para isolar as células imunes, primeiro coloque o baço em um coador de células de 40 micrômetros em uma placa de petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo no prato. Recupere as células aderidas enxaguando o êmbolo e o coador com 1 mililitro de HBSS 2% FCS. Em seguida, pipeta o baço dissociado e fluido da placa de petri em um tubo centrífuga de 50 mililitros. Lave a placa de petri com 5 mililitros de HBSS 2% FCS e transfira o fluido para o tubo de 15 mililitros.

Centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, recuperar o tubo cuidadosamente para não perturbar a pelota. Agora, remova o sobrenante sem perturbar a pelota e descarte o líquido em um recipiente de resíduos apropriado. Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de potássio de cloreto de amônio ao tubo de centrífuga e pipeta para cima e para baixo para resuspengar a pelota e lise os eritrócitos. Aguarde dois minutos e adicione HBSS 2% de FCS à pelota resuspended para obter um valor total de 14 mililitros. Repita a centrifugação. Recupere o tubo cuidadosamente e descarte o supernatante. Em seguida, resuspenda a pelota em 5 mililitros HBSS 2% FCS por pipetting para cima e para baixo. Em seguida, conte as células em suspensão. Adicione cinco microliters de azul trypan a cinco microliters de suspensão celular e misture bem por pipetação. Em seguida, deposite suavemente uma gota de cinco microlitera de suspensão celular diluída entre o vidro de cobertura e o slide Malassez. Com o microscópio definido para ampliação de 40X, conte o número de células. Ajuste a concentração celular para 10 às sete células por mililitro adicionando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

Para iniciar a transferência adotiva, transfira dois mililitros da suspensão celular para um tubo de coleta de cinco mililitros. Centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, descartar o supernasal. Em seguida, resuspende a pelota em dois mililitros de salina tamponada de fosfato e centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte o supernatante. Em seguida, resuspenja a pelota em 200 microliters de salina tamponada de fosfato. Usando uma seringa de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 29, injete 200 microliters de suspensão celular no camundongo experimental intravenosamente no seio sanguíneo retro-orbital.

Quatro dias após a transferência adotiva, eutanásia os ratos e remova os baços. Em seguida, colher as células imunes como descrito na seção três. Em seguida, transfira 100 microliters de suspensão celular de cada rato para dois tubos FACS rotulados controle e transferidos. Centrifugar os tubos a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e depois descartar os supernacantes. Agora, prepare uma mistura contendo os quatro anticorpos na diluição listada na tabela um. Adicione 100 microliters da mistura a cada tubo e, em seguida, incubar por 20 minutos no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% DE FCS a cada tubo e, em seguida, centrifugar os tubos a 370 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius. Descarte os supernantes e, em seguida, ressuspenja as pelotas em 200 microliters de HBSS 2% FCS. Transfira as células resuspended para novos tubos FACS rotulados. Agora, use a citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS para avaliar a presença de CD45. 2 linfócitos positivos.

Agora, determinaremos a presença de linfócitos CD45.2 que foram isolados do CD45. 1 baço de anfitrião. Para iniciar, clique duas vezes no ícone FlowJo e arraste os arquivos para cada tubo na janela de todas as amostras. Em seguida, clique duas vezes no arquivo transferido para exibir as células registradas a partir dessa amostra em um gráfico de ponto que exibe a dispersão para a frente FSCA no eixo x e dispersar lateralmente SSCA no eixo y. Clique no polígono para circular as populações de linfócitos. Uma nova janela de identificação de subpopulação aparece. Clique em OK. Agora, defina o eixo y para FSC-W e o eixo x para FSC-A. Selecione a população de célula única com a ferramenta polígono como demonstrado anteriormente.

Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela para as células selecionadas. Na nova janela, selecione CD45.2 no Y e CD45.1 no X. Clique no ícone T e personalize o eixo para ampliar o plot. Em seguida, clique no polígono para circular as células positivas CD45.2. Na janela de identificação de subpopulação, nomeie sua população celular transferida células e clique em OK. Na mesma janela, clique em retângulo para selecionar as células negativas cd45.2. Na janela de identificação de subpopulação, nomeie as células de hospedagem da população celular e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada cd45.2, população transferida, para criar uma nova janela para as células selecionadas. Na nova janela, selecione CD3 no Y e CD4 no X.

Em seguida, clique no polígono para circular as células positivas CD4 CD3. Nesta janela de identificação de subpopulação, nomeie sua população celular transferida células CD4. Em seguida, repita as etapas de análise anteriores com o arquivo do mouse de controle. Finalmente, para visualizar suas populações celulares, clique em Layout Editor. Arraste as células transferidas e a população de células CD4 transferidas de arquivos transferidos e de controle para a guia Layout Editor. Um gráfico de pontos representando células positivas CD45.2 e linfócitos CD4 aparecerá. CD45. 2 células transferidas só devem aparecer no gráfico de pontos do mouse transferido.

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Results

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Os camundongos ragγc têm uma composição alterada do sistema imunológico, principalmente sem linfócitos. A transferência adotiva de esplenócitos permite a introdução de populações carentes, como células T e B. Nossa coloração incluiu marcadores de superfície celular CD45.1 e CD45.2 para distinguir células hospedeiras edoadoras, respectivamente( Figura 2A). Também incluiu outros marcadores de superfície celular para destacar populações de células ausentes em camundongos Ragγc, como células CD4 T(Figura 2B). Como esperado, o mouse de controle não tinha células CD45.2 positivas(Figura 2B, painéis superiores) e o mouse transferido(Figura 2B, painéis inferiores, 71,2% do total de células). Também podemos detectar especificamente células CD4 T dentro de células transferidas (22,1% das células CD45.2).

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos da transferência adotiva. (A) Histogramas de células CD45.2 de camundongos injetados com PBS (grupo controle) (tracejado) e camundongos injetados com esplenócitos CD45.2 (grupo de teste) (linha sólida). (B) Estratégia de gating de células CD45.2 positivas em camundongos de controle injetados com PBS (painéis superiores) e camundongos injetados com esplenócitos CD45.2 (painéis inferiores). As células doadoras e hospedeiras são distinguidas usando marcadores de superfície celular (CD45.1, CD45.2), então a população celular CD45.2 positiva é caracterizada (CD3, CD4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Applications and Summary

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Transferência adotiva é uma técnica translacional em diferentes campos da ciência, com aplicações na medicina. Essa técnica pode ser usada para estudar migração celular e tropismo ou incidência de deficiência de proteínas em populações celulares específicas. No último caso, diferentes tecnologias podem ser usadas, especialmente camundongos transgênicos, onde populações de células específicas são intrinsecamente deficientes. No entanto, a construção genética para obter camundongos transgênicos pode ser um processo muito complexo e longo. Neste caso, a transferência adotiva da população celular deficiente é mais fácil e rápida.

As transferências adotivas têm aplicações diretas na medicina. Por exemplo, enxertos de medula óssea em pacientes irradiados durante a terapia do câncer são usados para reconstituir o sistema imunológico. Recentemente, outras aplicações de transferência adotiva têm sido utilizadas na área médica. As células T artificiais (chamadas célula CAR T) são projetadas para reconhecer e eliminar alguns cânceres. Além disso, essas células projetadas são construídas para amortecer o risco de rejeição pelo hospedeiro. A transferência de células CAR T é atualmente testada em ensaios clínicos.

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References

  1. Restifo, N. P., Dudley, M. E. and Rosenberg., S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nature reviews. Immunology, 12 (4): 269-281, (2012).
  2. Bonini, C., and Mondino, A. Adoptive T-cell therapy for cancer: The era of engineered T cells. European journal of immunology, 45 (9): 2457-69, (2015).

Transcript

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