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Transferencia celular adoptiva: Introducción de los cenocitos del ratón del donante a un ratón anfitrión y evaluación del éxito a través de FACS

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La transferencia celular adoptiva es un método para introducir células de interés en un organismo. Es una técnica poderosa para estudiar varios mecanismos biológicos, incluyendo la acción de clases específicas de células inmunitarias. Además, la transferencia adoptiva es un tratamiento novedoso prometedor para numerosas afecciones, como las que requieren trasplantes de médula ósea o tratamientos oncológicos en los que las células T de un paciente pueden extraerse, modificarse para reconocer y destruir las células cancerosas, y luego regresó al cuerpo para combatir tumores.

En el laboratorio, los modelos animales se utilizan a menudo para estudiar la transferencia adoptiva. Por ejemplo, los ratones eliminatorios CD45.1 gamma-c rag carecen de receptores fundamentales para muchas citoquinas, que son esenciales para la diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas en linfocitos. Como resultado, los ratones noqueadores tienen un desarrollo de linfocitos comprometido y no tienen muerte natural, o NK, células, células T o células B.

La transferencia adoptiva se puede utilizar para introducir las células inmunitarias que faltan en estos ratones comprometidos, mediante la primera cosecha de tejido de ratón donante que contiene altas concentraciones de células inmunitarias, como el bazo. Luego, el tejido se disocia y se aíslan una variedad de células del bazo, incluidas las células inmunitarias. A continuación, los eritrocitos no deseados, o glóbulos rojos, se pueden liscar mediante la adición de tampón de lisión de potasio de cloruro de amonio y los glóbulos blancos restantes, o esplenocitos, se separan de los desechos celulares mediante centrifugación.

Finalmente, los esplenocitos purificados se inyectan en los ratones inmunocomprometidos, facilitando estudios detallados de las funciones de estas células. Varios días más tarde, el éxito de la transferencia adoptiva de células inmunitarias se puede confirmar primero aislando y preparando los esplenoncitas del huésped de la misma manera que el tejido del donante. Luego, estas células se tiñen usando anticuerpos etiquetados contra los marcadores de células inmunitarias del donante para que puedan ser verificadas y ordenadas usando FACS.

Para empezar, ponte guantes de laboratorio y el equipo de protección adecuado. A continuación, lave un par de fórceps y diseccione las tijeras primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego séquelos con una toalla de papel limpia. Prepare 50 mililitros de solución de sal equilibrada de Hank, o HBSS, con 2% de suero de pantorrilla fetal, o FCS, combinando un mililitro de FCS con 49 mililitros de HBSS en un tubo de 50 mililitros. Mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.

Diseccionar el ratón eutanasiado y quitar su bazo como se demuestra en la tecnología FACS del protocolo de vídeo JoVE para la separación de linfocitos B esplénicos. Para aislar las células inmunitarias, coloque primero el bazo en un colador de células de 40 micrómetros en un plato de petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo en el plato. Recupere las células adheridas encerrando el émbolo y el colador con 1 mililitro de HBSS 2% FCS. Luego, pipetee el bazo disociado y el líquido de la placa petri en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Lavar la placa de petri con 5 mililitros de HBSS 2% FCS y transferir el fluido al tubo de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados Centígrados y luego recuperar el tubo con cuidado para no molestar el pellet. Ahora, retire el sobrenadante sin molestar el pellet y deseche el líquido en un contenedor de residuos apropiado. A continuación, agregue dos mililitros de tampón de lising de potasio de cloruro de amonio al tubo de centrífuga y pipeta hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y lijar los eritrocitos. Espere dos minutos y luego agregue HBSS 2% FCS al pellet resuspendido para obtener un valor total de 14 mililitros. Repite la centrifugación. Recupere el tubo con cuidado y deseche el sobrenadante. A continuación, resuspender el pellet en 5 mililitros HBSS 2% FCS por pipeteo hacia arriba y hacia abajo. A continuación, cuente las celdas en suspensión. Agregue cinco microlitros de trippan azul a cinco microlitros de suspensión celular y mezcle bien pipeteando. A continuación, deposite suavemente una gota de cinco microlitros de suspensión de celda diluida entre el vidrio de la cubierta y el portaobjetos Malassez. Con el microscopio ajustado a aumento de 40X, cuente el número de células. Ajuste la concentración celular a 10 a las siete células por mililitro agregando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

Para comenzar la transferencia adoptiva, transfiera dos mililitros de la suspensión celular a un tubo de recolección de cinco mililitros. Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados Centígrados y luego desechar el sobrenadante. A continuación, resuspende el pellet en dos mililitros de solución salina tamponada de fosfato y centrifuga el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Descarta el sobrenadante. A continuación, resuspenda el pellet en 200 microlitros de solución salina tamponada de fosfato. Usando una jeringa de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 29, inyecte 200 microlitros de suspensión celular en el ratón experimental por vía intravenosa en el seno de la sangre retroorbital.

Cuatro días después de la transferencia adoptiva, eutanasia a los ratones y retire el bazo. Luego, cosecha las células inmunitarias como se describe en la sección tres. A continuación, transfiera 100 microlitros de suspensión celular de cada ratón a dos tubos FACS etiquetados como control y transferidos. Centrifugar los tubos a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar los sobrenatonos. Ahora, prepare una mezcla que contenga los cuatro anticuerpos en la dilución enumerada en la tabla uno. Añadir 100 microlitros de la mezcla a cada tubo y luego incubar durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y luego centrifugar los tubos a 370 veces g durante tres minutos a 10 grados centígrados. Deseche los sobrenadores y luego resuspenda los pellets en 200 microlitros de HBSS 2% FCS. Transfiera las celdas resuspendidas a los nuevos tubos FACS etiquetados. Ahora, utilice la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS para evaluar la presencia de CD45. 2 linfocitos positivos.

Ahora, determinaremos la presencia de linfocitos CD45.2 que fueron aislados del CD45. 1 bazo de host. Para empezar, haga doble clic en el icono FlowJo y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana de muestra. A continuación, haga doble clic en el archivo transferido para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en una gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia delante FSCA en el eje X y la dispersión lateral SSCA en el eje Y. Haga clic en polígono para rodear las poblaciones de linfocitos. Aparece una nueva ventana de identificación de subpoblación. Haga clic en Aceptar. Ahora, establezca el eje Y en FSC-W y el eje X en FSC-A. Seleccione la población de celda única con la herramienta poligonal como se ha demostrado anteriormente.

A continuación, haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana para las celdas seleccionadas. En la nueva ventana, seleccione CD45.2 en Y y CD45.1 en la X. Haga clic en el icono T y personalice el eje para ampliar el trazado. A continuación, haga clic en polígono para rodear las celdas positivas CD45.2. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las celdas transferidas de la población de celdas y haga clic en Aceptar. En la misma ventana, haga clic en rectángulo para seleccionar las celdas negativas CD45.2. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las celdas de host de población de celdas y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población en círculos CD45.2, población transferida, para crear una nueva ventana para las celdas seleccionadas. En la nueva ventana, seleccione CD3 en La Y y CD4 en la X.

A continuación, haga clic en polígono para rodear las celdas positivas CD4 CD3. En esta ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a la población de celdas que transfiera las celdas CD4. A continuación, repita los pasos de análisis anteriores con el archivo de mouse de control. Por último, para visualizar las poblaciones de celdas, haga clic en Editor de diseño. Arrastre las celdas transferidas y la población de celdas CD4 transferidas desde archivos transferidos y de control a la pestaña Editor de diseño. Aparecerá una gráfica de puntos que representa células positivas CD45.2 y linfocitos CD4. CD45. 2 celdas transferidas solo deben aparecer en la gráfica de puntos del ratón transferida.

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