Overview
מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד1,2,ויטני סוונסון2,3ותומאס ס. גריפית'1,2,3,4
1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
אחת הפונקציות העיקריות של תאי מערכת החיסון היא להסיר תאי יעד שנדבקו בווירוסים או עברו טרנספורמציה לתא גידול. מביכה לבדיקות למדידת היכולת הציטוטוקסית של תאי מערכת החיסון היו מרכיב עיקרי במעבדות במשך שנים רבות. בדיקות אלה שימשו כדי לקבוע את היכולת של תאי T, תאי NK, או כל תא חיסוני אחר להרוג תאי מטרה באופן אנטיגן ספציפי או לא ספציפי. ליגנדים של מוות (למשל, ליגנד פאס או TRAIL), ציטוקינים (למשל, IFNg או TNF), או גרגירים ציטוטוקסיים (כלומר, perforin/granzyme B) המובעים על ידי תאים משפיעים הן כמה דרכים שבהן מוות תאי היעד יכול להיגרם. עם הפיצוץ במחקר אימונותרפי הגידול בשנים האחרונות, יש עניין גובר במציאת סוכנים כדי להגביר את הפעילות הציטוטוקסית של תאי החיסון כדי לשפר את תוצאות המטופל. לעומת זאת, מחלות מסוימות מסומנות על ידי פעילות מוגזמת של פעילות ציטוטוקסית של תאי מערכת החיסון, וכתוצאה מכך מאמצים לזהות סוכנים למתן תגובות אלה. לכן, לאחר מבחן שבו המשתמש יכול בקלות לשלב כל מספר של תאים משפיעים שונים, תאי יעד, ו / או מכפילי תגובה לתוך העיצוב הניסיוני יכול לשמש כאמצעי יקר ערך להערכה מהירה של היכולת הציטוטוקסית של תאים אפקטים ו / או התגובה של תא היעד.
בדיקות במבחנה אלה כרוכות בערבוב של אוכלוסיות תאים שונות, כמו גם באמצעות מספר נמוך יחסית של תאים משפיעים ויעד. לכן, אחד הצורך של ה- assay הוא לתייג את תאי היעד באופן שניתן לזהות בקלות כמות, ומאפשר למשתמש אז לקבוע את "אחוז תמוגה ספציפית" בתיווך התאים המשפיעים. רדיואקטיביות - במיוחד, כרום 51 (51Cr) בצורה של Na251CrO4- היא דרך זולה לתייג במהירות ולא מדעית חלבונים תאיים בתוך תאי היעד (1). התיוג הקצר ואת זמני ההסתה הכוללת מקטין את הפוטנציאל לשינויים משמעותיים במספר ו /או פנוטיפ של תאי היעד, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ההסתה. עם אובדן שלמות הממברנה של תאי היעד כתוצאה מהפעילות הציטוטוקסית של התאים האפקטורקטיביים, 51החלבונים התאיים המסומנים על-ידי Cr בתוך תאי היעד משתחררים לתוך ה- supernatant התרבותי, הופכים לזמינים לכמות. כמו בכל בדיקה הבוחנת את תפקוד תאי החיסון במבחנה, ישנם מספר שיקולים חשובים לשקול שיפור ביצועי הניסוי. אחת התכונות הקריטיות ביותר היא להשתמש במשפיע בריא (לפעילות ציטוטוקסית מקסימלית) ולמקד (להיענות מקסימלית ומוות ספונטני מינימלי/51Cr שחרור) תאים. נדרש מגע עם אפקט ותא יעד (מה שמוביל לשימוש נפוץ בלוחות עגולים בני 96 בארות כדי לעודד מגע בין תאים) (2). לבסוף, ניתוח הנתונים תלוי בהכללה של אוכלוסיות תאי יעד שליטה חיובית ושלילית.
הפרוטוקול הבא יתווה את השלבים לביצוע בדיקת שחרור סטנדרטית של 51Cr כדי למדוד את היכולת הציטוטוקסית של אוכלוסייה של תאים משפיעים, אם כי לאחרונה פותחה גרסה לא רדיואקטיבית באמצעות Europium. 51 Cr הוא פולט קרינת γ רב עוצמה. כתוצאה מכך, השימוש בבדיקה זו דורש אימון בטיחות קרינה נאות, שטח מעבדה ייעודי, מונה גמא וסילוק דגימות רדיואקטיביות.
רצף האירועים הכללי בבחינה זו הם: 1) להכין 51מטרות מתויגות Cr; 2) להכין תאים אפקט ולהוסיף צלחת בזמן תאי היעד הם תיוג; 3) להוסיף יעדים מסומנים לצלחת; 4) צלחת דגירה; 5) קציר סופר-טבעי; ו-6) לנתח נתונים לאחר הפעלת דגימות על מונה. דגימות מוכנות בדרך כלל במשולש, ולאחר מכן ממוצע להסביר את כל הבדלי pipetting עדין.
PPE נכון חשוב לבדיקה זו. באופן ספציפי, המשתמש צריך ללבוש חלוק מעבדה וכפפות. משקפי בטיחות עשויים להידרש על בסיס המעבדה או המוסד. צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ב- 51Cr במהלך כל השלבים. לבסוף, צריך להיות שטח מעבדה ייעודי וציוד להפריש לשימוש 51Cr, כולל כל השילוט הנכון כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם 51Cr ודלפק גייגר מצויד בגשושית גמא כדי לסקור את החלל לזיהום אפשרי.
בתרגיל מעבדה זה, אנו נקבע את היכולת של תאים מונוניקלאריים אנושיים לדם היקפי (PBMCs), (CpG מגורה לעומת unstimulated) להרוג תאי מלנומה, באמצעות קו תא מלנומה אנושי WM793 כמודל ואת בדיקת שחרור כרום.
Procedure
מבט כולל על שגרה
ההסתה האופיינית של 51Cr-release למדידת מוות תאי כוללת את השלבים הבאים:
- ראשית, תאי היעד מסומנים עם Na2[51Cr]O4. זה מבדיל אותם מתאי האפקטים שבבחינה.
- בעוד שתאי היעד מתייגים, התאים האפקטור נאספות, ובאמצעות טכניקת הדילול הסדרתי, ירידה בטיטורציה של תאי האפקטור נוצרת בלוח בדיקת תחתון עגול של 96 באר.
- בסוף תיוג תא היעד, התאים נשטפים תחילה ולאחר מכן מספר קבוע של תאים מתווספים ללוח בדיקת ה- assay שכבר מכיל סדרה של דילול תאים משפיעים.
- לאחר מכן, תערובת התאים של אפקט היעד מודגרת לפרק זמן מוגדר כדי לאפשר אינטראקציה מספקת בתאים עם תאי היעד, כדי לתווך תמה של תאים.
- לבסוף, תרבות-העל נקצרים ונאספים לצינורות. כמות 51Cr היא כמות באמצעות מונה גמא.
- בסוף, הנתונים נאספים ומשמשים לחישוב "תמוגת התא הספציפית באחוזים" של תאי היעד.
1. תיוג תאי יעד עם 51Cr
- כדי להתחיל, להכין את תאי היעד, (כאן - קו תא מלנומה אנושי WM793), לתוך השעיית תא יחיד.
- כדי לעשות זאת, ראשית להסיר את המדיה מן בקבוקון תרבית הרקמות.
- לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של 1X PBS.
- Trypsinize התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין לצלחת במשך ~ 2 דקות.
- הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מפני השטח הבקבוקון.
- הוסף 5 מ"ל של מדיית RPMI לבקבוקון והעבר את המדיה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים.
- לאסוף את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד. דקאנט סופר-טבעי.
- הוסף 10 מ"ל של מדיה לכדור וצינור בעדינות את המדיה למעלה ולמטה כדי להביא את התאים להשעיה.
- לקבוע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.
- העבר 1x106 תאים לתוך צינור חרוט חדש 15 מ"ל.
- צנטריפוגות מתלה התא במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד decant supernatant.
- מערבולת בקצרה את הצינור כדי resuspend גלולה התא בנפח הקטן של בינוני נשאר מאחור.
- הוסף 100 μCi של 51Cr ישירות להשעיית תא היעד WM793.
הערה: צריך להיות שטח מעבדה ייעודי שהוקם לרדיואקטיביות המסוימת. בנוסף, צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש ב- 51Cr במהלך כל השלבים, כמו גם שילוט מתאים כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם 51Cr. מונה גייגר המצויד בגשושית פנקייק הוא גם הכרחי, לסקר את המרחב לזיהום אפשרי. - הוסף חתיכה קטנה של סרט רדיואקטיבי לצינור כדי לציין כי הצינור הוא עכשיו רדיואקטיבי.
- מניחים את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם מגן עופרת ודגרה למשך שעה אחת. תעיף את הצינור כל 15-20 דקות כדי להגדיל את ספיגת תאי המטרה של הכרום.
- לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את תאי היעד עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף 51Cr.
- צנטריפוגות התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות. דקאנט רדיואקטיבי FBS לשטוף לתוך מיכל פסולת מתאים.
- respend הכדור ולשטוף בפעם השנייה עם FBS. בדוק את הכדור עבור רדיואקטיביות משולבת באמצעות מונה גייגר.
- Resuspend הכדור במדיום מלא 10 מ"ל, השגת ריכוז תא של 105 תאים / מ"ל.
הערה: שלב ספירת התאים לאחר תיוג 51Cr מושמט כאן בעיקר מטעמי בטיחות. ניתן להניח כי ריכוז התא WM793 זהה כפי שהיה לפני תיוג 51Cr.
2. הכנת תאים משפיעים
- ניתן להשתמש במגוון תאים משפיעים, כגון תאי T אנושיים או עכבר ותאי NK. בדוגמה זו, PBMCs, מבודדים מדם שלם על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות סטנדרטית (לריכוז של 5x106), שימשו.
- כדי להתחיל, להוסיף 100 μL של תרבית רקמות בינוני לכל באר של אחת השורות (כאן שורה A, ראה טבלה 1) של צלחת עגולה 96-היטב. כאן, לא מתווספים תאים משפיעים, והם ישמשו "ריק" לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני 51Cr" מתאי היעד.
טבלה 1: 51Cr לשחרר פריסת assay: שורה A- תאים היעד (104 תאים / 100 μL) דגירה עם מדיה בלבד (יוצר 'ריק' לקביעת "שחרור מינימום / ספונטני 51Cr"). שורות B עד C - בארות המכילות אפקט שונה: יחסי תא יעד (E:T), הנעים בין 50:1 ל- 1.5:1. שורה H - תאי יעד (104 תאים /100 μL) דגירה עם 1% NP-40 (NP-40 lyses את תאי היעד, יצירת "מקסימום או סך של 51שחרור Cr"). כל יחס E:T נבדק משולש עבור כל מצב ניסיוני. מחשבי PBMCs ומחשבי PBM בעלי גירוי של עמודה 1-3 ומחשבי PBMC מגורה CPG.
- לאחר מכן, ליצור דילול תאים סדרתיים פי 2 של מחשבי ה- PBMCs (במשולש עבור כל מצב ניסיוני), כדי להשיג ריכוז תא אפקט הנע בין 5x105 ל 15,625 תאים / 100 μL של מדיה (כאן שורות B עד G).
הערה: בדוגמה זו, המחולל ההתחלתי: יחס תא היעד (E: T) הוא 50:1. עם זאת, ניתן להתאים יחס זה בהתאם לפרטים הניסיוניים. - השאר את השורה האחרונה ריקה (כאן שורה H) על-ידי אי הוספת תאים משפיעים לבארות אלה. (שורה זו תשמש ליצירת "ספירות כוללות/דקות, או (ג. p.m)" או "מהדורת 51Cr המרבית").
- מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שתאי היעד מוכנים להוספתם.
3. הוספת 51Cr שכותרתו WM793 תאי יעד לאסאי
- לאחר תקופת הדגירה, להסיר את תאי היעד מן האינקובטור לשטוף עם 5 מ"ל של FBS כדי להסיר כל עודף 51Cr.
- צנטריפוגה התאים ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגה ייעודית.
- הסר את שטיפת FBS (supernatant רדיואקטיבי) לתוך מיכל פסולת מתאים.
- חזור על שלב הכביסה על ידי שימוש חוזר את הכדור ב 5 מ"ל טרי של FBS.
- צנטריפוגות התאים שוב ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות.
- לבסוף, respend הכדור ב 10 מ"ל של מדיום מלא.
- יוצקים את ההשעיה של תא WM793 עם תווית 51Cr (105 תאים/מ"ל) למאגר ריאגנט חד פעמי.
- לאחר מכן, הוסף 100 μL של תאי יעד אלה שכותרתו, לכל באר של לוח התאים אפקט 96-well, באמצעות pipette רב ערוצי.
- לאחר מכן, להוסיף 100 μL של 1% NP-40 (במים) לשורת הבארות כי הם נטולי כל תאים אפקט (כאן שורה H). 1% NP-40 יהיה ליזה את תאי היעד, ולכן בארות אלה ישמשו פקדים כדי לקבוע את "ספירה כוללת / דקה, או (c. p.m)" או את המהדורה המרבית 51Cr.
- אבטחו את המכסה לצלחת על ידי הוספת פיסת סרט קטנה חדירת גז לכל צד של הצלחת ומניחים פיסת סרט רדיואקטיבי על המכסה כדי לציין שהיא מכילה 51Cr.
- בקצרה, צנטריפוגה הצלחת ב 1200 סל"ד. אם נעשה שימוש בלוח ניסוי אחד בלבד, הוסיפו צלחת איזון לצנטריפוגה.
הערה: חשוב להשתמש בצנטריפוגה המסומנת לטיפול בדגימות רדיואקטיביות. - מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה.
- מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם חתיכת עופרת קטנה שמגנה על הצלחת לבטיחות נוספת. דגירה במשך 16 שעות כדי לאפשר תמה של תאי היעד.
הערה: תקופת הדגירה יכולה להשתנות בין 4 ל 18 שעות בהתאם לתאי האפקטים המשמשים ומנגנון פוטנציאלי של הרג מועסק.
4. קצירת סופרנטנטים
- בסוף תקופת הדגירה, להסיר בזהירות את הסרט סביב קצה הצלחת ולהסיר את המכסה.
- לאחר מכן, מניחים את מסגרת הקציר על הצלחת, ומוודאים לאשר כי דיסקי המסנן הקטנים נמצאים במקום עבור כל אחד מצעי הכותנה. זה יבטיח את האוסף של סופרנט ללא תאים.
- עכשיו, לאט ובעדינות לחץ על תקעי הכותנה לתוך בארות.
- לאחר כ -10 שניות, לשחרר את הלחץ על תקעים כותנה ולאחר מכן להעביר את תקעים כותנה לרצועות צינור.
- מניחים כל אחד מהצינורות האלה לתוך צינור FACS משני.
- לבסוף, לטעון צינורות FACS על מונה גמא ולהפעיל את הדגימות כדי כמות של 51Cr שוחרר בכל תנאי. דגימות נמדדות בדרך כלל במשך דקה אחת, ומאפשרות קביעה קלה של "ספירות / דקה".
- בזהירות, להקליט את הסדר שבו הצינורות היו טעונים לתוך הדלפק.
5. ניתוח נתונים
- כאן, מחשבי PBMCs לא מנוסים נוספו לשלוש העמודות הראשונות, ומחשבי PBMCs מגורה CpG (CpG ODN, (1 מיקרוגרם/מ"ל) עבור 24 שעות) נוספו לעמודות 4-6. ראה טבלה 2.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| A | 1251 | 1157 | 1086 | 917 | 1118 | 1140 | ||
| B | 1832 | 1986 | 1971 | 7629 | 7913 | 8180 | ||
| C | 1677 | 1739 | 1428 | 5454 | 5055 | 5268 | ||
| D | 1638 | 1552 | 1734 | 4239 | 3582 | 3786 | ||
| E | 1658 | 1580 | 1339 | 2818 | 2623 | 2750 | ||
| F | 1579 | 1472 | 1483 | 2028 | 1779 | 1769 | ||
| G | 1326 | 1325 | 1184 | 1801 | 1654 | 1565 | ||
| H | 9220 | 9367 | 8067 | 8774 | 9647 | 8236 | ||
| אני | ממוצע של A1,A2,A3 -> | 1164.67 | סי.פי ספונטני.m | 1058.33 | ||||
| J | ממוצע של B1,B2,B3 -> | 1929.67 | 9.91% | 7907.33 | 87.50% | 50:1 | ||
| K | ממוצע של C1,C2,C3 -> | 1614.67 | 5.83% | 5259 | 53.67% | 25:1 | ||
| L | ממוצע של D1,D2,D3 -> | 1641.33 | 6.17% | 3869 | 35.91% | 12.5:1 | ||
| M | ממוצע של E1,E2,E3 -> | 1525.67 | 4.68% | 2730.33 | 21.36% | 6.25:1 | ||
| N | ממוצע של F1,F2,F3 -> | 1511.33 | 4.49% | 1858.67 | 10.22% | 3.12:1 | ||
| O | ממוצע של G1,G2,G3 -> | 1278.33 | 1.47% | 1673.33 | 7.86% | 1.56:1 | ||
| P | ממוצע H1,H2,H3 -> | 8884.67 | מקסימום C.p.m | 8885.67 | ||||
| Unstim PBMC | CpG-stim PBMC | יחס E:T | ||||||
טבלה 2: 51Cr לשחרר נתוני צ'ק: ערכי נתונים 'ספירה לדקה' / 'c. p.m', ערכי c. p.m ממוצעים וערכי תמותה ספציפיים באחוזים מחושבים.
- הנתונים שנאספו (ספירות לדקה, כלומר.c.p.m) הוזנו לתאי גיליון אלקטרוני באותו אופן שבו הדגימות הונחו בלוח המקורי.
- ראשית, הממוצעים של הטריפליקאטים חושבו. טבלה 2 - תאים I3 עד P3, עבור מחשבי PBMCs ותאים לא מנוסים I6 עד P6, עבור מחשבי PBMC מגורה CpG.
- לאחר קביעת הממוצעים, אחוז תמיסת הספציפית עבור כל תנאי חושב באמצעות הנוסחה הבאה-
- אחוז תמוגה ספציפית חושב עבור כל תנאי (טבלה 2 - תאים J4 עד O4, עבור מחשבי PBMCs unstimulated ו- J7 ל- O7, עבור מחשבי PBMCs לא מנוסים).
בסרטון זה תוכלו לראות כיצד לבצע את כרום לשחרר את ההסתה ולקבוע את הפוטנציאל הציטוטוקסי של התאים המשפיעים.
תאי מערכת החיסון אחראים לזיהוי והסרה של תאים שעלולים להזיק, כמו סרטן או תאים נגועים בווירוס, מהגוף, המהווה חלק בלתי נפרד מהתגובה החיסונית. מספר תאי מערכת החיסון, כמו תאי T ותאי NK, מחזיקים ברכוש המכונה פוטנציאל ציטוטוקסי, שהוא היכולת לזהות תאי יעד ולהפריך חלבונים הגורמים להשפלת חלבונים, תמוגה ומוות של תאי יעד אלה. כימות הפוטנציאל הציטוטוקסי הוא קריטי למדידת ההפעלה והעוצמה של תאי מערכת החיסון, ובוחאי שחרור הכרום משמשים בדרך כלל למטרה זו.
שיטה זו מאפשרת למשתמשים להשוות ציטוקסיות הנגרמת על ידי סוגים מסוימים של תאי מערכת החיסון בתנאים שונים, אשר בעל ערך לחקר אימונותרפיה של סרטן ומחלות הקשורות לחסינות. בתור התחלה, תאי היעד, כמו תאים סרטניים, מדגירים עם איזוטופ רדיואקטיבי, כרום 51, אשר נלקח על ידי התאים. לאחר מכן, תאים אלה המסומנים בתרבית רדיו מתורבתים במשותף עם תאי החיסון המבודדים, הנקראים גם תאי האפקטיביות, בתחתית עגולה, 96- צלחת טובה כדי להקל על אינטראקציה בין שני סוגי התאים.
ההתקנה הכוללת של ה- assay כוללת דגירה של מספר מסוים של תאי יעד בריכוזים שונים של תאי החיסון, יחד עם פקדים מתאימים. תרבית המשנה מאפשרת לתאי האפקטור לגרום לאפופטוזיס ולתסיסה בתאי היעד, וכתוצאה מכך שחרורו של הכרום התאי 51 לתוך supernatant. ואז, בנקודת זמן טרום-אופטימלית, הסופר-טבעי המכיל את הכרום המשוחרר נקצר מכל בארות. הכרום 51, בהיותו רדיואקטיבי, עובר באופן ספונטני ריקבון רדיואקטיבי כדי לפלוט קרינת גמא. רמות קרינת הגמא בסופרנטים מכל הבארות בלוח בדיקת ה- assay מייצגות תפוקה הניתנת לכימות של תמוגת תאי המטרה. זה נמדד באמצעות מונה גמא, אשר משמש לאחר מכן כדי לקבוע את הפוטנציאל הציטוטוקסי של תאי החיסון.
בתור התחלה, תאי היעד, קו תא מלנומה אנושי WM793 בדוגמה זו, מוכנים לתוך השעיית תא יחיד. כדי לעשות זאת, ראשית להסיר את המדיה מן בקבוקון תרבית הרקמות לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של 1X PBS. דקנט PBS ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין לצלחת במשך כשתי דקות. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים מפני השטח הבקבוק ולאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של מדיה RPMI לבקבוקון. Pipette התקשורת למעלה ולמטה כדי לאסוף את התאים ולהוסיף השעיה זו לצינור חרוט 15 מיליליטר.
מניחים את הצינור בצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 1200 סל"ד. לאחר מכן, להסיר את המדיה מן הצינור מוודא לא לשבש את גלולה התא. בעדינות להעיף את החלק התחתון של הצינור כדי לשבש את גלולה התא ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיה לצינור. לאחר מכן, בעדינות pipette התקשורת למעלה ולמטה כדי להביא את התאים להשעיה. לאחר מכן, לקבוע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer ולהעביר שני מיליליטר של השעיית התא המקורי לצינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. מניחים את הצינור לתוך צנטריפוגה וכדור את התאים ב 1200 סל"ד במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, לשפוך את המדיה העודפת מתוך הצינור לתוך מיכל פסולת. מערבולת בקצרה את הצינור כדי resuspend גלולה התא בנפח הקטן של בינוני נשאר מאחור.
לאחר מכן, היכונו לשימוש בכרום 51 על ידי מעבר לחלל מעבדה המוקדש לרדיואקטיביות מסוימת זו. צריך להיות מיגון עופרת בשפע לאחסון בטוח ושימוש בכרום 51 במהלך כל השלבים, כמו גם שילוט מתאים כדי לציין היכן נשמרות דגימות עם כרום 51. דלפק גייגר המצויד בגשושית פנקייק יש צורך גם לשרת בחלל לזיהום אפשרי.
לאחר הגדרת לשימוש נכון של רדיואקטיביות, להוסיף 100 מיקרוקורסיביות של כרום 51 ישירות השעיית תא היעד. לאחר מכן, הוסף חתיכה קטנה של סרט רדיואקטיבי לצינור כדי לציין כי המדגם ואת הצינור הם עכשיו רדיואקטיבי. מניחים את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם מגן עופרת ודגרה במשך שעה, מהבהבים בצינור כל 15 עד 20 דקות.
בזמן שתאי היעד מסומנים, הכינו השעיית תא בודד של תאים משפיעים. בדוגמה זו, תאים גרעיניים מונו דם היקפיים אנושיים, או PDMCs, היו מבודדים מדם שלם על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות סטנדרטית לריכוז של 5 פעמים 10 עד 6. העבר השעיית תא אפקט זה למאגר ריאגנט חד פעמי ולאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטרים של השעיה זו לכל באר של שורה B בלוח עגול 96 היטב. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של RPMI לכל באר בשורה C עד G של הצלחת.
כעת, התחל לבצע דילול טורי של מחשבי ה- PBMCs כדי לקבל טווח של מספרי תאים משפיעים על-ידי הסרת תחילה 100 מיקרוליטרים של התאים בבארות בשורה B והוספתם לשורה C. לאחר מכן, לדלל עוד יותר את התאים האפקטורליים על-ידי העברת 100 מיקרוליטרים של תאים משורה C לשורה D. המשך הדילול הטורי. לאחר הגעת שורה G, הזז 100 מיקרוליטרים מהבארות כדי להשאיר נפח סופי של 100 מיקרוליטרים בכל באר בשורה זו. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבית הרקמות לבארות בשורה A כדי לשמש בקרה לשחרור ספונטני של כרום 51 מתאי היעד, מכיוון שאין להוסיף תאים משפיעים לשורה זו. לאחר מכן, מניחים צלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שתאי היעד מוכנים להוספתם.
לאחר תקופת הדגירה, להסיר את תאי היעד מן האינקובטור לשטוף עם 5 מיליליטר של FBS כדי להסיר כל עודף כרום 51. לאחר מכן, מניחים את הצינור בצנטריפוגה ייעודית ומסתובבים ב-1200 סל"ד למשך 5 דקות. הסר את לשטוף FBS רדיואקטיבי לתוך מיכל פסולת מתאים ולחזור על שלב לשטוף על ידי שימוש חוזר את הכדור 5 מיליליטר טרי של FBS. מניחים את הצינור בצנטריפוגה ייעודית ומסובבים את התאים שוב ב-1200 סל"ד למשך 5 דקות. הסר את לשטוף השני ולבדוק את הכדור עבור רדיואקטיביות משולבת באמצעות מונה גייגר. לבסוף, Resuspend הכדור ב 10 מיליליטר של בינוני מלא ולשפוך את כרום 51 שכותרתו, השעיית תא היעד לתוך מאגר ריאגנט חד פעמי. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של תאי יעד אלה המסומנים לכל באר של צלחת תא אפקט 96-well. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של 1% NP-40 במים לבארות בשורה H כדי ללחתוך את כל תאי היעד בכל שורה. בארות אלה ישמשו כפקד כדי לקבוע את סך הספירה לדקה, או עלות לאלף חשיפות.
עכשיו כשהצלחת מוכנה, אבטחו את המכסה על ידי הוספת פיסת סרט דבק קטנה לכל צד של הצלחת והניחו פיסת סרט רדיואקטיבי על המכסה כדי לציין שהיא מכילה כרום 51. לאחר מכן, מניחים את הצלחת בצנטריפוגה המסומנת לטיפול בדגימות רדיואקטיביות. אם נעשה שימוש בלוח ניסוי אחד בלבד, הוסיפו צלחת איזון לצנטריפוגה. הגדר את הצנטריפוגה ל 1200 סל"ד, ולהביא את הצלחת עד מהירות. פעם אחת במהירות, לעצור את המכונה. מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה. לאחר מכן, מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם חתיכת עופרת קטנה המגינה על הצלחת לבטיחות נוספת. דגירה במשך 16 שעות כדי לאפשר לתאי היעד להתיז.
בסוף תקופת הדגירה, להסיר בזהירות את הסרט סביב קצה הצלחת, ולהסיר את המכסה. לאחר מכן, מניחים את מסגרת הקציר על הצלחת ומוודאים לאשר את דיסקי המסנן הקטנים נמצאים במקום עבור כל אחד מצעי הכותנה. עכשיו, לאט ובעדינות לחץ על תקעי הכותנה לתוך בארות. לאחר כעשר שניות, לשחרר את הלחץ על תקעים כותנה, ולאחר מכן להעביר את תקעים כותנה לרצועות צינור. מניחים כל אחד מהצינורות האלה לתוך צינור FACS משני. לבסוף, לטעון את צינורות FACS על מונה גמא ולהפעיל את הדגימות כדי כמות של כרום 51 שוחרר בכל תנאי. תיעד בזהירות את הסדר שבו הצינורות הועמסו לתוך הדלפק.
כאן, מחשבים אישיים לא מנוסים נוספו ל-3 הנתיבים הראשונים ומחשבי PMB מגרה CPG נוספו לנתיבים 4 עד 6. בדוגמה זו, הספירה לדקה הוזנו לתאים של גיליון אלקטרוני באותו אופן שבו הדגימות הונחו בלוח המקורי וממוצעי הטריפליקאטים חושבו. לדוגמה, עבור התנאי הראשון, התאים A1, A2 ו- A3 היו בממוצע בתא I3. לאחר קביעת הממוצעים, ניתן לחשב את אחוז תמיסת lysis ספציפית עבור כל תנאי באמצעות נוסחה זו. לדוגמה, כדי לחשב את אחוז תמוגה ספציפית עבור התאים unstimulated כי היה יחס של 50 ל 1 תאים אפקט למקד תאים CPM ספונטני, אשר בדוגמה זו, הוא 1164.67, הופחת מן CPM ניסיוני, 1129. 67. לאחר מכן ניתן לחלק מספר זה בהפרש בין ה- CPM המרבי לבין ה- CPM הספונטני, ולאחר מכן מוכפל ב - 100 כדי לתת את האחוז תמה ספציפית. לאחר מכן, אפשרות זו מחושבת עבור כל תנאי. לאחר מכן ניתן לגרף נתונים אלה כדי להציג השוואה של יחס E ל- T עם התמוגה הספציפית באחוזים הן עבור מחשבי ה- PBMCs הלא מנויים והן עבור מחשבי ה- PBMCs המושרים על-ידי CPG. בדוגמה זו, תאים משפיעים מגורה עם CPG ביעילות רבה יותר נהרג תאי היעד כמו היחס של תאים משפיעים לתאי היעד גדל. עלייה זו לא נצפתה PBMCs unstimulated, המציין כי גירוי CPG יש צורך עלייה נצפתה תמוגה תא היעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
בדוגמה זו, תאים משפיעים מגורה עם CpG (איור 1, עיגולים שחורים) הרגו את תאי היעד בצורה יעילה יותר, ככל שהיחס בין התאים האפקטיביים לתאי היעד גדל. עלייה זו לא נצפתה PBMCs unstimulated (עיגולים לבנים),המציין כי גירוי CpG נחוץ עבור הגידול שנצפה תמוגה תא היעד.
איור 1: 51Cr assay פיזור עלילה: פעילות גידול על ידי מחשבים אישיים אנושיים, ללא גינוי(עיגולים לבנים)ולאחר גירוי עם CpG(עיגולים שחורים),נבדק במשפיע שונה: יחסי תא היעד (E: T) היחסים (הנעים בין. 50:1 ל- 1.5:1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
ההבחנה המתוארת כאן יש גמישות רבה, כמו מגוון של אפקט ותאי יעד ניתן להשתמש בהתאם לשאלה הנשאלת. לדוגמה, הספציפיות לתאי האפקטים יכולה להיקבע על ידי שימוש בתאי מטרה שונים או מנגנון של הרג תאים משפיע יכול להיקבע על ידי שימוש בתאים לקויים בחלבונים ספציפיים או באמצעות מעכבים ספציפיים לחלבון. בעיה מרכזית עם 51Cr שחרור assay הוא הפוטנציאל לשיעורי שחרור ספונטניים גבוהים על ידי תאי היעד. כאשר תרבית לבד (ללא תאים אפקט), שחרור ספונטני של 51Cr על ידי תאי היעד צריך להיות באופן אידיאלי לא יותר מ 30% של שחרור הכולל ("מקסימלי") על ידי תאי היעד מיד lysis. שיעורי שחרור ספונטניים גבוהים יותר עשויים להיות כתוצאה משימוש בתאי יעד לא בריאים, בין אם בשל בריאות לקויה (למשל, תרבית מורחבת של קו תאים) או תקופת תיוג ארוכה מדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
- Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).
