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细胞死亡测定:细胞毒性能力的铬释放测定
 

细胞死亡测定:细胞毒性能力的铬释放测定

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在本视频中,您将观察如何执行铬释放测定并确定效应细胞的细胞毒性电位。

免疫细胞负责从体内识别和去除潜在的有害细胞,如癌症或病毒感染细胞,这是免疫反应不可分割的一部分。几个免疫细胞,如T细胞和NK细胞,具有一种称为细胞毒性电位的特性,即识别目标细胞和分泌蛋白质的能力,这些蛋白质会诱导蛋白质降解、易莱和这些目标细胞死亡。量化细胞毒性潜能物对于测量免疫细胞活化和效力至关重要,铬释放测定通常用于此目的。

该方法使使用者能够比较不同条件下特定类型的免疫细胞引起的细胞毒性,对研究癌症免疫疗法和免疫相关疾病有价值。首先,目标细胞,如癌细胞,用放射性同位素铬51孵育,由细胞承担。接下来,这些无线电标记细胞与感兴趣的分离免疫细胞共同培养,也称为效应细胞,在圆底,96孔板,以促进两种细胞类型之间的相互作用。

测定的整体设置包括孵育具有不同免疫细胞浓度的特定数量的目标细胞,以及适当的对照。共培养允许效应细胞诱导目标细胞中的凋亡和解变,导致细胞内铬51释放到上清液中。然后,在预先优化的时间点,从所有井中采集含有释放铬的上清液。铬51是放射性的,它自发地经历放射性衰变,发出伽马辐射。来自测定板中所有孔的上生子中的伽马辐射水平代表目标细胞的解片的可量化输出。这是使用伽玛计数器测量的,然后用于确定免疫细胞的细胞毒性电位。

首先,本例中的目标细胞,人类黑色素瘤细胞系WM793,准备成单个细胞悬浮液。为此,首先从组织培养瓶中取出介质,用5毫升1X PBS清洗细胞。将PBS分给,然后加入一毫升的胰蛋白酶到盘子里大约两分钟。轻轻敲击烧瓶,将细胞从烧瓶表面松开,然后将五毫升 RPMI 介质添加到烧瓶中。上下移液介质以收集细胞,并将此悬浮液添加到 15 毫升锥形管中。

以 1200 RPM 将管子放入离心机中五分钟。接下来,从管中取出介质,确保不会破坏细胞颗粒。轻轻轻拂管底部以破坏细胞颗粒,并将 10 毫升的介质添加到管中。然后,轻轻上下移液介质,使细胞悬浮。接下来,使用血细胞计确定细胞浓度,并将两毫升的原始细胞悬浮液转移到新的15毫升锥形管中。将管子放入离心机,以12百RPM转速对细胞进行5分钟的粒状。离心后,将多余的介质从管中倒入废物容器中。短暂涡旋管,在留下的小体积中重新悬浮细胞颗粒。

接下来,准备使用铬51,移动到专用于此特定放射性的实验室空间。所有步骤都应有足够的铅屏蔽,以便安全储存和使用铬 51,并正确标识,以指示铬 51 样品的存放位置。盖革计数器配有煎饼探头,也是空间中可能污染时所必需的。

一旦设置正确使用放射性,将100个铬51微固化直接添加到目标细胞悬浮液中。然后,在管子里加入一小块放射性胶带,表明样品和管子现在具有放射性。将管子置于带有铅屏蔽的 37 摄氏度培养箱中,孵育一小时,每 15 到 20 分钟轻拂一次管。

当目标细胞进行标记时,准备一个细胞悬浮效应细胞。在此示例中,人类外周血单核细胞(PdMC)通过标准密度梯度离心从全血中分离出来,浓度为5倍10至6。将该效应器电池悬浮液转移到一次性试剂罐中,然后将200微升的这种悬浮液添加到96孔圆底板中B行的每个井中。接下来,在板的 C 行到 G 中,将 100 微升的 RPMI 添加到每个孔中。

现在,开始执行 PBMC 的串行稀释,以便首先去除 B 行中孔中的 100 微升细胞,并将其添加到 C 行中,从而具有一系列效应细胞数。然后,通过将100微升的细胞从C行转移到D行,进一步稀释效应细胞。到达 G 行后,从井中移出 100 微升,使该行中每口井的最终体积为 100 微升。接下来,在A排的井中加入100微升的组织培养基,作为从目标细胞中自发释放铬51的控件,因为不应向此行添加任何效应细胞。然后,将一个板放入37摄氏度的培养箱中,直到目标细胞准备好被添加。

孵育期后,从培养箱中取出目标细胞,用5毫升的FBS清洗,以去除任何多余的铬51。然后,将管子放在指定的离心机中,在 1200 rpm 转速下旋转 5 分钟。将放射性 FBS 洗涤液放入适当的废物容器中,通过将颗粒重新悬浮在新鲜 5 毫升 FBS 中来重复洗涤步骤。将管子放在指定的离心机中,在 1200 rpm 转速下再次旋转细胞 5 分钟。使用盖革计数器取出第二次清洗并检查颗粒是否包含放射性。最后,将颗粒重新悬浮在10毫升的完整介质中,并将标有铬51的铬51,目标细胞悬浮液倒入一次性试剂罐中。然后,将100微升这些标记的目标细胞添加到96孔效应细胞板的每个孔中。接下来,在H行的井中加入100微升的1%NP-40,以对每行的所有目标细胞进行分莱。这些井将用作控制,以确定每分钟的总计数或 cpm。

现在,板已准备好,通过在板的两侧添加一小块胶带,并在盖子上放置一块放射性胶带,以指示其含有铬 51,从而固定盖子。然后,将板放在标有处理放射性样品的离心机中。如果只使用一个实验板,向离心机添加平衡板。将离心机设置为 1200 rpm,并将板调至转速。一旦达到速度,停止机器。从离心机中取出板。然后,将板放在 37 摄氏度的培养箱中,在板上放置一小块铅屏蔽,以保障安全性。孵育16小时,使目标细胞解毒。

在孵育期结束时,小心地取下板边缘周围的胶带,然后取下盖子。接下来,将收获框架放在板上,确保每个棉塞的小滤盘都到位。现在,慢慢地轻轻地将棉塞压入井中。大约十秒钟后,释放棉塞上的压力,然后将棉塞转移到管条上。将每个管子放入辅助 FACS 管中。最后,将FACS管加载到伽玛计数器上,并运行样品,以量化每种条件下释放的铬51量。仔细记录将管子装入柜台的顺序。

在这里,未刺激的PBMC被添加到前3个车道,CPG刺激PMBC被添加到车道4至6。在此示例中,以与在原始板上放置样本相同的方式将每分钟计数输入到电子表格的单元格中,并计算了三元数的平均值。例如,对于第一个条件,单元格 A1、A2 和 A3 在单元格 I3 中求平均值。确定平均值后,可使用此公式计算每个条件的特定莱沙百分比。例如,为了计算非刺激细胞的特异性解白百分比,其作用细胞与靶向细胞的比率为 50 比 1,从实验 CPM 1129 中减去自发 CPM(在此示例中为 1164.67)。67. 然后,这个数字可以除以最大 CPM 和自发 CPM 之间的差值,然后乘以 100 给出特定裂莱的百分比。然后为每个条件计算。然后,这些数据可以绘制成图表,以显示 E 到 T 比率与未刺激的 PBMC 和 CPG 刺激的 PBMC 的特定莱沙百分比的比较。在此示例中,随着效应细胞与目标细胞的比例增加,用CPG刺激的效应细胞更有效地杀死目标细胞。在未刺激的PBMC中未观察到这种增加,表明CPG刺激对于观察到的目标细胞解说的增加是必要的。

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