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Mise à mort cellulaire: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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Dans cette vidéo, vous observerez comment effectuer l'analyse de libération de chrome et déterminer le potentiel cytotoxique des cellules effectrices.

Les cellules immunitaires sont responsables de l'identification et de l'élimination des cellules potentiellement nocives, comme le cancer ou les cellules infectées par le virus, du corps, qui fait partie intégrante de la réponse immunitaire. Plusieurs cellules immunitaires, comme les lymphocytes T et les cellules NK, possèdent une propriété connue sous le nom de potentiel cytotoxique, qui est la capacité d'identifier les cellules cibles et de sécréte des protéines qui induisent la dégradation des protéines, la lyse et la mort de ces cellules cibles. La quantification du potentiel cytotoxique est essentielle pour mesurer l'activation et la puissance des cellules immunitaires, et l'analyse de libération de chrome est couramment utilisée à cette fin.

Cette méthode permet aux utilisateurs de comparer la cytoxicité induite par des types spécifiques de cellules immunitaires dans des conditions différentes, ce qui est précieux pour l'étude de l'immunothérapie contre le cancer et les maladies liées à l'immunité. Pour commencer, les cellules cibles, comme les cellules cancéreuses, sont incubées avec un isotope radioactif, le chrome 51, qui est pris par les cellules. Ensuite, ces cellules étiquetées par radio sont co-cultivées avec les cellules immunitaires isolées d'intérêt, également appelées les cellules effectrices, dans un fond rond, 96-puits plaque pour faciliter l'interaction entre les deux types de cellules.

La configuration globale de l'analyse implique l'incubation d'un nombre spécifique de cellules cibles avec des concentrations différentes des cellules immunitaires, ainsi que des contrôles appropriés. La co-culture permet aux cellules effectrices d'induire l'apoptose et la lyse dans les cellules cibles, ce qui entraîne la libération du chrome intracellulaire 51 dans le supernatant. Puis, à un moment préoptimisé, le supernatant contenant le chrome libéré est récolté dans tous les puits. Le chrome 51, radioactif, subit spontanément une désintégration radioactive pour émettre des radiations gamma. Les niveaux de rayonnement gamma dans les supernatants de tous les puits de la plaque d'analyse représentent une sortie quantifiable de la lyse des cellules cibles. Ceci est mesuré à l'aide d'un compteur gamma, qui est ensuite utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique des cellules immunitaires.

Pour commencer, les cellules cibles, la lignée cellulaire du mélanome humain WM793 dans cet exemple, sont préparées en une suspension cellulaire unique. Pour ce faire, d'abord retirer le support de la flacon de culture tissulaire et laver les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS. Décant le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine à la plaque pendant environ deux minutes. Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon, puis ajoutez cinq millilitres de milieu RPMI au flacon. Pipette le média de haut en bas pour recueillir les cellules et ajouter cette suspension à un tube conique de 15 millilitres.

Placer le tube dans la centrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ensuite, retirez le support du tube en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire. Faites glisser doucement le fond du tube pour perturber la pastille cellulaire et ajouter 10 millilitres de support au tube. Ensuite, pipette doucement le média de haut en bas pour amener les cellules en suspension. Ensuite, déterminez la concentration cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre et transférez deux millilitres de la suspension cellulaire d'origine à un nouveau tube conique de 15 millilitres. Placer le tube dans une centrifugeuse et granuler les cellules à 12 cents tr/min pendant cinq minutes. Après centrifugation, verser l'excès de support du tube dans un contenant à déchets. Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.

Ensuite, préparez-vous à utiliser le chrome 51 en déménageant dans un laboratoire dédié à cette radioactivité particulière. Il devrait y avoir un large blindage au plomb pour le stockage et l'utilisation sécuritaires du Chrome 51 pendant toutes les étapes, ainsi qu'une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec du chrome 51 sont conservés. Un compteur Geiger équipé d'une sonde à crêpes est également nécessaire pour servir dans l'espace pour une contamination possible.

Une fois mis en place pour l'utilisation appropriée de la radioactivité, ajouter 100 microcuries de chrome 51 directement à la suspension de la cellule cible. Ensuite, ajoutez un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que l'échantillon et le tube sont maintenant radioactifs. Placez le tube dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec un bouclier de plomb et incubez pendant une heure, en faisant glisser le tube toutes les 15 à 20 minutes.

Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, préparez une suspension cellulaire unique des cellules effectrices. Dans cet exemple, les cellules nucléaires périphériques humaines de sang, ou PDMCs, ont été isolées du sang entier par la centrifugation standard de gradient de densité à une concentration de 5 fois 10 au 6ème. Transférer cette suspension de cellules effector dans un réservoir de réactif jetable, puis ajouter 200 microlitres de cette suspension dans chaque puits de la rangée B dans une plaque de 96 puits à fond rond. Ensuite, ajouter 100 microlitres de RPMI à chaque puits dans la rangée C à travers G de la plaque.

Maintenant, commencez à effectuer des dilutions en série des PBMC s'acquiescent à une gamme de nombres de cellules effectrices en enlevant d'abord 100 microlitres des cellules dans les puits de la rangée B et en l'ajoutant à la rangée C. Ensuite, diluer davantage les cellules effectrices en transférant 100 microlitres de cellules de la rangée C à la rangée D. Continuer la dilution en série. Une fois la rangée G atteinte, déplacez 100 microlitres des puits pour laisser un volume final de 100 microlitres dans chaque puits de cette rangée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture tissulaire aux puits de la rangée A pour servir de contrôle pour la libération spontanée de chrome 51 des cellules cibles, car aucune cellule effectrice ne devrait être ajoutée à cette ligne. Ensuite, placez une plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

Après la période d'incubation, retirer les cellules cibles de l'incubateur et laver avec 5 millilitres de FBS pour enlever tout excès de chrome 51. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse désignée et faites tourner à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le lavage radioactif de FBS dans un récipient approprié de déchet et répétez l'étape de lavage en rependant le granule dans un frais 5 millilitres de FBS. Placer le tube dans une centrifugeuse désignée et faire tourner les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le deuxième lavage et vérifiez la radioactivité incorporée à l'aide d'un compteur Geiger. Enfin, resuspendre la pastille en 10 millilitres de milieu complet et verser le Chrome 51 étiqueté, suspension de cellule cible dans un réservoir de réactif jetable. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de ces cellules cibles étiquetées à chaque puits de la plaque de cellules effectrices de 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 1% NP-40 dans l'eau aux puits de la rangée H pour lyser toutes les cellules cibles de chaque rangée. Ces puits seront utilisés comme un contrôle pour déterminer le nombre total par minute, ou cpm.

Maintenant que la plaque est préparée, fixer le couvercle en ajoutant un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté de la plaque et placer un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu'il contient du chrome 51. Ensuite, placez la plaque dans une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d'équilibre à la centrifugeuse. Mettre la centrifugeuse à 1200 tr/min et mettre la plaque à jour. Une fois à la vitesse, arrêtez la machine. Retirer la plaque de la centrifugeuse. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec un petit morceau de plomb protégeant sur la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 heures pour permettre aux cellules cibles de lyse.

À la fin de la période d'incubation, retirez soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirez le couvercle. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits. Après environ dix secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire. Enfin, chargez les tubes FACS sur un compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de chrome 51 libérée dans chaque condition. Enregistrez soigneusement l'ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.

Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux 3 premières voies et des CBP stimulés par le CGP ont été ajoutés aux voies 4 à 6. Dans cet exemple, les comptes par minute ont été entrés dans les cellules d'une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d'origine et les moyennes des triplicats ont été calculées. Par exemple, pour la première condition, les cellules A1, A2 et A3 ont été moyennes dans la cellule I3. Une fois que les moyennes sont déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition peut être calculé à l'aide de cette formule. Par exemple, pour calculer la lyse spécifique pour cent pour les cellules non stimulées qui ont eu un rapport de 50 pour 1 cellules effectrices aux cellules cibles le CPM spontané, qui dans cet exemple, est 1164.67, a été soustrait du CPM expérimental, 1129. 67. Ce nombre peut alors être divisé par la différence entre le CPM maximum et le CPM spontané, puis multiplié par 100 pour donner la lyse spécifique pour cent. Ceci est ensuite calculé pour chaque condition. Ces données peuvent ensuite être graphiques pour montrer la comparaison du rapport E/T avec la lyse spécifique pour cent pour les PBMC non stimulés, et le CPG stimulé PBMCs. Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées avec cPG ont plus efficacement tué les cellules cibles à mesure que le rapport des cellules effectrices aux cellules cibles augmentait. Cette augmentation n'a pas été observée dans les PBMC non stimulés, ce qui indique que la stimulation du CPG est nécessaire pour l'augmentation observée de la lyse cellulaire cible.

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