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Dilutions et placages en série : énumération microbienne

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Parfois, afin d'identifier et d'étudier les bactéries, nous devons d'abord les isoler et les enrichir à partir d'un échantillon. Par exemple, les échantillons obtenus à partir d'une colonne Winogradsky sont mélangés, ce qui signifie qu'ils contiennent plusieurs espèces ou souches de bactéries, de sorte que l'étude d'une bactérie individuelle ou l'énumération des différents types présents peuvent être difficiles. À cette fin, des techniques de dilution et de placage en série sont généralement utilisées pour quantifier de façon fiable la charge bactérienne et isoler les colonies individuelles.

La dilution en série est un processus par lequel la concentration d'un organisme, les bactéries dans cet exemple, est systématiquement réduite par la résuspension successive dans les volumes fixes de diluant liquide. Habituellement, le volume du diluant est un multiple de 10 pour faciliter la réduction logarithmique de l'organisme échantillon. Par exemple, un gramme de sédimenteste est d'abord retiré de la zone d'intérêt de Winogradsky et ajouté à 10 millilitres d'un milieu liquide approprié. Ensuite, un millilitre de cette première dilution est ajouté à un autre tube contenant neuf millilitres de milieu. Le processus peut être répété jusqu'à ce que plusieurs concentrations différentes de bactéries ont été préparées. La dilution en série est la clé de l'énumération des bactéries dans cet exemple, puisque les échantillons mélangés d'une colonne Winogradsky contiennent un nombre inconnu, souvent important, de bactéries.

Ensuite, le placage et le placage de propagation permettent l'isolement et l'énumération des bactéries dans un échantillon, respectivement. Le strage est accompli en introduisant un échantillon dilué dans une section du milieu solide complétée par des éléments nutritifs, qui sont divisés en tiers. Cet inoculum est ensuite réparti sur chaque tiers de la plaque en zigzag. Comme différentes sections de la plaque sont striées, traversant de l'échantillon précédent qu'une seule fois, l'échantillon est réparti plus finement. Cela signifie que vous n'aurez peut-être besoin que de strier d'une dilution pour atteindre des colonies individuelles dans les sections ultérieures. Après l'incubation, les plaques stries permettent d'observations de la morphologie des colonies, des informations qui peuvent aider à différencier les différentes espèces bactériennes.

Alternativement, si l'objectif principal est l'énumération des bactéries dans le placage de propagation de l'échantillon peut être utilisé. Dans le placage de propagation, un aliquot d'un seul échantillon est réparti uniformément sur toute la surface du milieu solide. Typiquement, parce que nous ne connaissons pas les nombres bactériens dans l'échantillon mélangé, une plaque de propagation est faite pour chacune des dilutions ou un échantillon représentatif d'entre eux. Après l'incubation, l'énumération peut être effectuée à l'aide de ces plaques de propagation. Toutes les plaques dont le nombre de colonies est inférieur à 30 doivent être jetées, car les petits dénombrements sont sujets à une plus grande erreur. De même, tout dénombrement de plus de 300 devrait être éliminé parce que l'encombrement des colonies et le chevauchement peuvent conduire à une sous-estimation du nombre de colonies. Si le nombre de la colonie de chacun de ces plats restants est enregistré et multiplié par le facteur de dilution, puis divisé par le volume plaqué, cela donne à la colonie formant des unités, ou CfUs, par millilitre de suspension. Dans cette vidéo, vous apprendrez comment évaluer qualitativement et quantitativement un échantillon contenant une bactérie connue, et les communautés microbiennes contenues dans diverses régions d'une colonne Winogradsky par dilution en série, placage de propagation, et placage de stries.

Tout d'abord, mettez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes. Ensuite, stérilisez l'espace de travail avec 70% d'éthanol et essuyez la surface. Ensuite, rassemblez deux flacons Erlenmeyer de 500 millilitres et étiquetez un bouillon et l'autre agar. Pour préparer la solution lb agar, mélanger environ 6,25 grammes de gélose LB, trois grammes d'agar technique, et 250 millilitres d'eau distillée dans la flasque étiquetée agar.

Ensuite, préparer le bouillon LB en combinant 2. 5 grammes de support LB et 100 millilitres d'eau distillée dans le bouillon étiqueté flacon. Après l'autoclacage des flacons, utilisez un gant résistant à la chaleur pour enlever les flacons de l'autoclave et placez-les dans un bain d'eau de 40 à 50 degrés Celsius. Une fois que les flacons sont de 50 degrés Celsius, préparer soigneusement trois aliquots de 100 millilitres de la solution de bouillon et étiqueter chaque solution aliquot zéro. Ensuite, rassemblez 10 boîtes stériles de petri et étiquetez-les avec la date, le nom, le type de support utilisé, et la zone de colonne de Winogradsky que les organismes seront récoltés à partir. Pipette 15 millilitres d'agar de la flacon d'agar dans chaque plat de Petri. Ensuite, utilisez la pointe de pipette pour enlever les bulles, remplacer les couvercles de plaque, et leur permettre de se solidifier sur le dessus du banc pendant la nuit.

Le lendemain, essuyez le dessus du banc avec 70% d'éthanol. Ensuite, étiquetez 10 tubes à essai de 20 millilitres T1 à T10 et placez-les dans un rack. Pipette neuf millilitres de 0,45% salin dans chaque tube. Maintenant, couvrez chacun des 10 tubes d'essai lâchement avec leurs bouchons et transférez-les à un support de tube à essai autoclave-compatible. Une fois le cycle terminé, retirer les blancs salins à l'aide de gants résistants à la chaleur et leur permettre de refroidir. Conservez les tubes à température ambiante jusqu'à ce qu'ils atteignent environ 22 degrés Celsius.

Pour cultiver un organisme cible connu, E. coli dans cet exemple, inoculer 100 millilitres de solution zéro avec une seule colonie d'une plaque précédemment strié. Ensuite, couvrez le tube et incubez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour évaluer les régions d'une colonne Winogradsky, ajouter environ un gramme de matière de la zone aérobie à T1 et resuspendre par vortexing. Ensuite, répétez ce processus avec un gramme de matériau de la zone anaérobie.

Retirez le tube contenant la solution zéro inoculée avec E. coli de l'incubateur et secouez-le. Ensuite, pipette un millilitre de la solution dans un tube à essai T1 et vortex à mélanger. Retirez un millilitre de solution de T1 et transférez-le à T2, vortexing pour mélanger. Répétez ce processus par tube T10. Pour évaluer les zones aérobies et anaérobies de la colonne Winogradsky, retirez un millilitre de solution de chacun des tubes T1 préalablement préparés et transférez-la aux tubes T2 appropriés. Ensuite, continuez les dilutions en série à travers les tubes T10 comme indiqué précédemment.

Pour étaler la plaque, pipette 100 microlitres de l'échantillon dilué de chaque tube T3 sur le plat de petri correspondant. Ensuite, utilisez une tige d'épandage stérile pour distribuer délicatement l'échantillon sur le plat de Petri et remplacer le couvercle de l'assiette. Répétez ce processus pour les dilutions T6 et T9, comme précédemment démontré. Incuber les plaques contenant des organismes aérobies dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Incuber les plaques contenant des organismes anaérobies dans une chambre anaérobie fixée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, retirez les plaques de dilution T3, T6 et T9 de l'incubateur et de la chambre anaérobie et transférez-les sur le banc. En travaillant avec une plaque à la fois, faites glisser une boucle inoculation stérile sur le dessus des médias en zigzag. Ensuite, remplacez le couvercle de la boîte à pétri. Ensuite, faites pivoter la plaque par 1/3 et stérilisez la boucle pour réduire la fréquence du motif en zigzag déjà fait. Encore une fois, après avoir stérilisé la boucle, faites pivoter la plaque de 1/3, réduisez la fréquence du motif en zigzag une dernière fois et remplacez le couvercle. Répétez cette méthode de stries pour les plaques restantes, comme indiqué précédemment. Ensuite, placez les plaques striées contenant des organismes aérobies dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant la nuit et les plaques striées contenant des organismes anaérobies dans une chambre anaérobie fixée à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Les cultures ont été récoltées dans les zones aérobies et anaérobies d'une colonne Winogradsky de sept jours. Ensuite, les cultures ont été diluées en série avant de strier et de se répandre sur des plaques d'agar LB. Streaking a révélé une population mixte de chacune des zones Winogradsky évaluées, et les plaques de propagation ont produit des résultats similaires. Une plaque strié d'une population mixte se traduira par des colonies bactériennes de différentes formes, tailles, textures et couleurs. En revanche, les plaques stries et répandues contenant l'organisme connu, E. coli, ont démontré une population homologue. En général, il est préférable de calculer les UFC par millilitre en utilisant le nombre moyen de colonies de trois plaques réparties avec le même échantillon et le même facteur de dilution. Multipliez le nombre moyen de colonies par le facteur de dilution et divisez par la quantité indiquée. Enfin, les colonies isolées choisies dans chaque plaque peuvent être utilisées dans d'autres essais d'enrichissement pour déterminer l'identité de l'espèce.

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