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连续稀释和电镀:微生物枚举
 

连续稀释和电镀:微生物枚举

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有时,为了识别和研究细菌,我们首先需要从样本中分离和丰富细菌。例如,从维诺格拉茨基柱获得的样本是混合的,这意味着它们包含多种细菌或菌株,因此研究单个细菌或列举存在的不同种类可能具有挑战性。为此,通常采用连续稀释和电镀技术可靠地量化细菌负荷和分离单个菌落。

连续稀释是一个过程,通过这一过程,通过连续悬浮在固定体积的液体稀释剂中,生物体(本例中所示的细菌)的浓度被系统地降低。通常稀释剂的体积是10的倍数,以促进样本生物体的对数减少。例如,首先从维诺格拉茨基感兴趣区域去除一克沉积物,并加入到10毫升适当的液体介质中。然后,将一毫升的这种第一稀释剂添加到另一个含有九毫升介质的管中。这个过程可以重复,直到几个不同浓度的细菌已经准备。在这个例子中,连续稀释是枚举细菌的关键,因为来自维诺格拉茨基柱的混合样品含有未知(通常是大量的)细菌。

接下来,条纹电镀和扩散电镀可分别在样品中分离和枚举细菌。条纹是通过将稀释的样品引入固体介质的一部分,辅以营养,这是分为三分之二。然后,此接种以锯齿形模式分布在板的每三分之一上。由于板的不同部分有条纹,与前一个样品仅交叉一次,因此样品分布得更薄。这意味着您可能只需要从一个稀释中条纹,在后面的部分实现单个殖民地。孵化后,条纹板允许观察菌落形态,这些信息可以帮助区分不同的细菌物种。

或者,如果主要目标是枚举细菌在样品传播电镀可以使用。在铺面电镀中,单个样品的等分均匀地分布在固体介质的整个表面上。通常,由于我们不知道混合样品中的细菌数量,因此为每个稀释剂或其中具有代表性的样本制作了一个扩散板。孵育后,可以使用这些扩散板进行枚举。任何菌落计数小于30的板都应该丢弃,因为小盘会有更大的误差。同样,任何超过300的计数都应该被丢弃,因为殖民地拥挤和重叠可能导致对殖民地计数的低估。如果记录每个剩余菜肴的菌落计数,并乘以稀释系数,然后除以镀料,则每毫升悬浮液产生菌群形成单位或 CFU。在本视频中,您将学习如何通过连续稀释、扩散电镀和条纹电镀,对含有已知细菌的样品以及维诺格拉茨基柱各个区域所含的微生物群落进行定性和定量评估。

首先,穿上任何适当的个人防护装备,包括实验室外套、手套和护目镜。接下来,用 70% 乙醇对工作空间进行消毒,然后擦拭表面。接下来,收集两个500毫升的Erlenmeyer烧瓶,并贴上一个汤和一个琼脂的标签。要制备 LB 琼脂溶液,在贴有标签的烧瓶中混合约 6.25 克 LB 琼脂、3 克技术琼脂和 250 毫升蒸馏水。

然后,通过组合 2 准备 LB 肉汤。5 克 LB 介质和 100 毫升蒸馏水,在标有肉汤的烧瓶中。高压灭菌瓶后,使用耐热手套将烧瓶从高压灭菌器中取出,并将其放入 40 至 50 摄氏度的水浴中。一旦烧瓶温度达到 50 摄氏度,请仔细准备三个 100 毫升的肉汤溶液等分,并将每个等分溶液标记为零。接下来,收集10个无菌培养皿,并标记它们的日期,名称,使用的介质类型,和维诺格拉茨基柱区,生物体将从中收获。从琼脂瓶中移入每个培养皿中的15毫升琼脂。然后,使用移液器尖端去除任何气泡,更换板盖,并让他们在台面上过夜凝固。

第二天,用70%的乙醇擦拭台面。接下来,标记 10 20 毫升试管 T1 到 T10,并将其放入机架中。将9毫升的0.45%盐水放入每个管中。现在,用盖子松散地覆盖10个试管中的每一个,并将其转移到与高压灭菌器兼容的试管机架上。循环完成后,使用耐热手套去除盐水坯,使其冷却。将管在室温下存放,直到达到约 22 摄氏度。

为了培育已知的目标生物体,本例中的大肠杆菌,用先前条纹的板中单一菌群接种100毫升溶液零。然后,覆盖管子,并在37摄氏度的温度下孵育。要评估维诺格拉茨基柱的区域,请从有氧区向 T1 添加大约一克材料,然后通过涡旋重新悬浮。然后,用来自厌氧区的一克材料重复此过程。

从培养箱中取出含有大肠杆菌溶液的管,并将其摇动。然后,将一毫升溶液移液放入T1试管和涡旋中混合。从 T1 中取出一毫升溶液并将其转移到 T2,涡旋混合。通过管 T10 重复此过程。要评估维诺格拉茨基柱的有氧和厌氧区,请从先前准备的 T1 管中去除一毫升溶液并将其转移到相应的 T2 管。然后,继续通过 T10 管进行串行稀释,如前面所示。

为了铺板,移液器100微升的稀释样品从每个T3管到相应的培养皿。然后,使用无菌扩张杆将样品轻轻地分发到培养皿上,并更换盘盖。如前所述,对 T6 和 T9 稀释重复此过程。在37摄氏度的培养箱中孵育含有有氧生物的板24小时。在设定为 37 摄氏度的厌氧室中孵育含有厌氧生物的板,24 小时。第二天,从培养箱和厌氧室中取出T3、T6和T9稀释板,并将其转移到工作台顶部。一次使用一个板,以锯齿形模式在介质顶部滑动无菌接种回路。然后,更换培养皿盖。接下来,将板旋转 1/3 并消毒循环,以减少先前制作的锯齿形图案的频率。再次,在消毒循环后,将板旋转 1/3,最后一次降低锯齿形图案的频率,然后更换盖子。如前所述,对其余板重复此条纹方法。然后,将含有有氧生物的带条纹板放在37摄氏度的培养箱中过夜,在厌氧室中设置有氧生物的带条纹板过夜至37摄氏度。

文化是从七天维诺格拉茨基柱的有氧和厌氧区收获的。然后,在LB琼脂板上条纹和扩散之前,这些文化被连续稀释。条纹揭示了来自每个评估的维诺格拉茨基区的混合种群,并且扩散板产生了类似的结果。从混合种群条纹的板将导致不同形状、大小、纹理和颜色的细菌菌落。相比之下,含有已知有机体的条纹和扩散板大肠杆菌则表现出同源种群。通常,最好使用具有相同样本和稀释因子的三个板的平均菌群计数来计算每毫升的CCF。将平均菌落数乘以稀释系数,再除以数量。最后,从每个板块中选择的分离菌落可用于进一步浓缩测定,以确定物种特性。

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