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シリアル希釈とめっき:微生物列挙

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時には、細菌を同定して研究するためには、まずサンプルからそれらを分離し、濃縮する必要があります。例えば、ウィノグラツキーカラムから得られたサンプルは混合され、複数の種または細菌の株が含まれているため、個々の細菌を研究したり、存在する異なる種類を列挙することは困難な場合があります。この目的のために、シリアル希釈およびめっき技術は、通常、細菌負荷を確実に定量し、個々のコロニーを分離するために使用される。

シリアル希釈は、この例における細菌である生物の濃度が、液体希釈液の固定量における連続的な再懸濁を通じて系統的に減少するプロセスである。通常、希釈体の体積は、サンプル生物の対数減少を容易にする10の倍数である。例えば、1グラムの堆積物は、まず目的のウィノグラツキーゾーンから除去され、適切な液体媒体の10ミリリットルに添加される。次に、この第1希釈の1ミリリットルを、培地の9ミリリットルを含む別のチューブに添加する。このプロセスは、いくつかの異なる濃度の細菌が調製されるまで繰り返すことができる。この例では、ウィノグラツキーカラムからの混合サンプルには未知の、しばしば大きな数の細菌が含まれているため、シリアル希釈は細菌の列挙の鍵となります。

次に、ストリークメッキとスプレッドメッキにより、サンプル内の細菌の単離と列挙が可能になります。ストリーキングは、3分の1に分けられる栄養素を補充した固形培地の1つのセクションに希釈されたサンプルを導入することによって達成される。この接種は、ジグザグパターンでプレートの各3分の1に広がります。プレートの異なるセクションが縞模様化され、前のサンプルから一度だけ交差すると、サンプルはより薄く広がります。つまり、後のセクションで個々のコロニーを達成するために、1つの希釈からストリークするだけで済む場合があります。インキュベーション後、縞模様のプレートは、コロニー形態の観察を可能にし、異なる細菌種を区別するのに役立つ情報を提供する。

あるいは、主な目的が試料拡散めっきにおける細菌の列挙である場合に使用してもよい。スプレッドメッキでは、単一のサンプルのアリコートが固体媒体の表面全体に均等に広がります。通常、混合サンプル中の細菌数がわからないため、各希釈またはそれらの代表的なサンプルに対してスプレッドプレートが作られます。インキュベーション後、これらのスプレッドプレートを用いて列挙を行うことができる。コロニー数が 30 未満のプレートは、小さいカウントが大きな誤差の影響を受けるため、破棄する必要があります。同様に、コロニーの混雑と重複がコロニー数の過小評価につながる可能性があるため、300を超えるカウントは破棄する必要があります。これらの残りの各料理のコロニー数を記録し、希釈係数を掛けてから、体積めっきで割ると、コロニー形成単位(CFC)が懸濁液1ミリリットル当たり生成されます。このビデオでは、既知の細菌を含むサンプルと、シリアル希釈、スプレッドメッキ、および筋めっきを使用してウィノグラツキーカラムの様々な領域に含まれる微生物群を定性的かつ定量的に評価する方法を学びます。

まず、ラボコート、手袋、ゴーグルなどの適切な個人用保護具を着用してください。次に、70%のエタノールでワークスペースを殺菌し、表面を拭き取ります。次に、2つの500ミリリットルのアーレンマイヤーフラスコを収集し、1つのスープと他の寒天にラベルを付けます。LB寒天溶液を調製するには、約6.25グラムのLB寒天、3グラムのテクニカル寒天、および寒天とラベル付けされたフラスコに蒸留水の250ミリリットルを混ぜます。

次いで、2を組み合わせてLBスープを調作する。5グラムのLB培養物と100ミリリットルの蒸留水をフラスコにラベル付けしたスープに入れます。フラスコをオートクレーブした後、耐熱手袋を使用してオートクレーブからフラスコを取り除き、40~50°Cの水浴に入れます。フラスコが摂氏50度になったら、スープ溶液の100ミリリットルのアリコートを3つ慎重に準備し、各アリコート溶液にゼロのラベルを付けます。次に、10の滅菌ペトリ皿を収集し、生物が収穫される日付、名前、使用されるメディアの種類、およびウィノグラツキーカラムゾーンでそれらをラベル付けします。寒天フラスコから各ペトリ皿に寒天のピペット15ミリリットル。その後、ピペットの先端を使用して気泡を除去し、プレートの蓋を交換し、一晩ベンチトップに固められるようにします。

翌日、70%のエタノールでベンチトップを拭きます。次に、T1からT10までの10 20ミリリットルの試験管にラベルを付け、ラックに入れます。各チューブに.45%生理食塩水のピペット9ミリリットル。次に、10個の試験管をそれぞれキャップでゆるく覆い、オートクレーブ対応の試験管ラックに移します。サイクルが完了したら、耐熱手袋を使用して生理食生のブランクを取り除き、冷却することができます。管は約22°Cに達するまで室温で保管してください。

既知の標的生物を培養するために、この例では大腸菌を、以前に縞模様のプレートから単一のコロニーで溶液ゼロの100ミリリットルを接種する。その後、チューブをカバーし、摂氏37度で一晩それをインキュベートします。ウィノグラツキーカラムの領域を評価するには、好気性ゾーンからT1に約1グラムの材料を追加し、渦によって再中断します。次に、嫌気性ゾーンから1グラムの材料でこのプロセスを繰り返します。

大腸菌を接種した溶液を含むチューブをインキュベーターから取り出し、振ります。次に、溶液の1ミリリットルをT1試験管と渦に混合して混合する。T1から溶液の1ミリリットルを取り出し、それをT2に移し、混ぜ合わせます。チューブT10を通してこのプロセスを繰り返します。ウィノグラツキーカラムの好気性および嫌気性ゾーンを評価するには、以前に調製したT1チューブから1ミリリットルの溶液を取り出し、適切なT2チューブに移します。次に、先に示したようにT10管を通してシリアル希釈を続ける。

プレートを広げるには、各T3チューブから対応するペトリ皿に希釈されたサンプルのピペット100マイクロリットル。次に、無菌の広がり棒を使用して、サンプルをペトリ皿に穏やかに分配し、プレート蓋を交換します。前に示したように、T6 および T9 希釈に対してこのプロセスを繰り返します。好気性生物を含むプレートを37°Cのインキュベーターで24時間インキュベートします。嫌気性の室内で嫌気性生物を含むプレートを24時間摂氏37度に設定します。翌日、インキュベーターと嫌気室からT3、T6、T9希釈プレートを取り出し、ベンチトップに移します。一度に1つのプレートで作業し、ジグザグパターンでメディアの上部を横切って無菌接種ループを滑走します。次に、ペトリ皿の蓋を交換します。次に、プレートを1/3回転させ、ループを殺菌して、以前に作られたジグザグパターンの周波数を減らします。繰り返しになりますが、ループを殺菌した後、プレートを1/3回転させ、ジグザグパターンの周波数を最後に1回減らし、蓋を交換します。前に示したように、残りのプレートに対してこのストリーキング方法を繰り返します。次に、好気性生物を含む縞板を一晩37°Cのインキュベーターに入れ、嫌気性の生物を含む縞板を一晩37°Cに設定します。

文化は7日間のウィノグラツキーコラムの好気性および嫌気性ゾーンから収穫された。その後、培養物を連続的に希釈し、LB寒天プレートに広げた。ストリーキングは、評価されたウィノグラツキーゾーンのそれぞれから混合集団を明らかにし、スプレッドプレートは同様の結果を生み出しました。混合集団から縞模様のプレートは、異なる形状、サイズ、テクスチャ、および色の細菌コロニーになります。対照的に、既知の生物大腸菌を含む縞および広がりプレートは、相同集団を示した。一般に、同じサンプルと希釈係数で広がる3つのプレートの平均コロニー数を使用して、1ミリリットル当たりのCFCを計算することをお算するのが最善です。コロニーの平均数に希釈係数を掛け、引用符で囲まれた量で除算します。最後に、各プレートから選択された単離されたコロニーは、種のアイデンティティを決定するために、さらなる濃縮アッセイに使用することができる。

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