Overview
资料来源：克里斯托弗·科博1，乔纳森·布莱泽1，伊丽莎白·苏特1
1大学生物科学系，瓦格纳学院，1 校园路，纽约州斯塔顿岛，10301
原核细胞能够栖息在这个星球上的几乎每一个环境。作为一个王国，它们具有巨大的代谢多样性，允许它们使用各种各样的分子来产生能量（1）。因此，在实验室中培养这些生物体时，必须在生长培养中提供制造能量所需的所有特定分子。虽然有些生物在代谢上是多种多样的，但其他生物能够在极端环境中生存，如高温或低温、碱性和酸性pH值、减少或缺氧环境，或含有高盐的环境（2，3，4）。这些生物体被称为"嗜血杆菌"，它们往往需要这些强烈的环境来增殖。当科学家寻找培育这些生物时，需要考虑到介质成分以及任何特定的环境条件，才能成功地培育出感兴趣的生物体。
科学家能够在实验室中培育出可培养的生物体，因为他们了解这些物种生长所需的具体要求。然而，可养殖生物在估计地球上的物种中所占不到1%（5）。通过基因测序检测到但无法在实验室中生长的生物体被认为是不可培养的（6）。目前，我们对这些生物体的新陈代谢和生长条件了解不够，无法在实验室中复制其环境。
挑剔的有机体位于前两者之间。这些生物是可培养的，但它们需要非常具体的生长条件，如特定的生长介质成分和/或特定的生长条件。这种属的两个例子是Neisseria sp.和血友病，这两个都需要部分分解的红血球（也称为巧克力琼脂），以及特定的生长因子和富含二氧化碳的环境（7）。如果没有所有必需的特定成分，这些生物体将根本不会生长。通常，即使满足所有要求，这些生物体的生长也很差。
与真核细胞不同，真核细胞只能在有氧或含氧环境中生长，而原核细胞则能够利用几种发酵途径进行厌氧生长，从而产生充足的能量（8）。其他原生核生物更喜欢亲微亲氧体，或减少氧气环境，甚至亲亲生物或高二氧化碳环境（9）。这些生物体更难以丰富，因为大气必须改变。经常与对含氧环境敏感的生物体工作的科学家通常会在厌氧室和孵化器中工作，在那里，大量惰性气体（如 argon）被泵送来取代氧气（10）。另一些则利用常规的密封气体包系统，利用水产生氢气和二氧化碳，以及像铂一样的催化剂来去除所有大气中的氧气。这些市售的试剂盒可产生上述任何大气条件（10）。
无论是培养病原体以确定潜在感染，还是希望确定自然环境中存在的特定细菌种类，都存在一个问题。没有一个细菌物种栖息在一个栖息地。细菌作为多细胞群落生活，从人类的皮肤到我们星球的海洋（11）。在试图分离一种细菌时，科学家必须努力排除同样居住在隔离区的其他许多生物。因此，细菌的富集生长介质往往具有两种功能。第一是使媒体有选择性。选择性剂会阻止某些物种生长，同时不抑制甚至经常促进其他物种的生长（12）。介质成分的第二个功能可能是作为差分剂工作。这种制剂可以识别一个孤立的生物体的一个特定的生化特征。通过将几种不同的选择性和差别介质与适当的生长条件配对，科学家和诊断学家能够从特定分离物中识别特定细菌物种的存在。
选择性和差别化介质有助于鉴定的一个例子是临床上重要的有机体金黄色葡萄球菌。这种有机体通常是在曼尼托盐琼脂培养的。这种介质不仅只选择生活在高盐环境中的生物体，其中包括一些克阳性物，如金黄色葡萄球菌，而且还抑制任何对盐敏感的生物体。甘醇糖是这种介质的差分成分。在所有临床上重要的金黄色葡萄球菌物种中，只有S.金黄色葡萄球菌能够发酵曼尼托。这种发酵反应产生酸作为副产品，导致介质中的红色甲基红色指示灯变黄。其他葡萄球菌物种（如金黄色葡萄球菌表皮）虽然能够生长，但会使介质呈红色。
本实验练习演示了适当的无菌技术，以及从肉汤中正确接种生长介质。它还介绍了浓缩介质上常见污染物生物的生长情况，使用气体包厌氧培养系统进行厌氧细菌，以及使用不同的选择性和差分介质对克进行推定鉴定阳性和克阴性细菌。
Procedure
1. 准备
- 出发前，请彻底洗手，戴上适当尺寸的手套。
- 用5%的次氯酸钠（漂白剂）对工作面进行消毒，并彻底干燥。
- 将接种回路放入空的 120 mL Erlenmeyer 烧瓶中，使其在工作时不会接触工作台面。
2. 成长媒体和文化
- 从冰箱中收集四盘曼尼托盐Agar（MSA）、Eosin亚甲蓝琼脂（EMB）和8个试胶大豆琼脂（TSA）（这些可以商业购买）。
- 将板放在清洁的工作区域。
- 收集以下肉汤培养物：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌表皮炎和蛋白石。注意：由于这些是有氧生物，管盖应稍微松弛。
- 将所有培养物放在清洁工作表面上的试管机架中。
3. 传播文化和孵化
- 站在或坐在长凳上，所有材料都触手可及。
- 要使用无菌技术将细菌转移到板中，首先点燃循环，直到它呈橙色发光 - 然后让它在空气中冷却。
- 当循环冷却时，取大肠杆菌的肉汤培养，然后用小指打开盖子。
- 迅速点燃管子的开口。这样可以防止污染。
- 将环浸入管中，将有机体条纹到 EMB 板的第一个象限上。
- 执行第一个条纹后，火焰循环，然后执行第二个条纹跨越第一个条纹只有一两次。这将允许单一殖民地隔离，并确定是否有任何污染。
- 重复此操作，直到板的所有四个象限都条纹。
- 现在，以相同的条纹电镀方式转移其余四个生物体，使最终产品为每个生物体提供一个 MSA 板、一个 EMB 板和两个单独的 TSA 板。
- 一旦所有生物体被转移，最后一次点燃环，然后把它收起来。
- 将1个TSA板与每个有机体放入气体包中，然后摇动一个气囊，然后放在板旁的腔室中。密封紧密。
- 在37°C下孵育所有板过夜。
- 最后一次用5%漂白剂对工作面进行消毒。
4. 阅读和录制结果
- 从培养箱中取出板，并将其放在干净的实验室工作台上
- 记下实验室笔记本中每个盘子上生物体的生长情况。特别是，请详细记录：
- 每个板上每个板的菌落数量和大小（如果存在）
- 生长在MSA板上的任何菌落周围的琼脂的外观
- 在EMB板块上生长的任何殖民地的外观
- 与气体封装内部相比，TSA 板块的生长差异
从沙漠冻土带到热带雨林，细菌几乎能栖息在地球上的每一个环境。这种对不同利基进行殖民的能力，是由于其适应性和巨大的代谢多样性，这使得它们能够利用各种各样的分子来产生能量。正是这种巨大的多样性导致这一现象，地球上不到1%的细菌物种被认为是可培养的，这些只有在了解其特定的代谢和环境需求才有可能。
在实验室中操作介质和环境，不仅使研究人员能够进行实验，找到培育感兴趣的物种的最佳条件，而且还使丰富性、不断变化的条件选择过程混合文化的特定物种。一些微生物物种是通才，能够容忍各种各样的状态或环境。这种生物体在实验室条件下可能很容易生长，但如果有极端的栖息地，它们也可能被阻止生长，如果目标是使混合培养体能够适应这种条件而富于生物体，这会有所帮助。
挑剔的生物体是可培养的，但只有当满足特定条件时。例如，奈瑟里亚或血友病物种需要含有部分分解红血球和高二氧化碳浓度的介质，这也可能阻碍其他物种的生长。极恋人因其对极端条件的偏好而得名，例如极低或高温、缺氧或缺氧条件，或存在高盐。这些情况可能是不能容忍的大多数其他微生物。
为了进一步丰富感兴趣的生物体，一些介质类型包含指标，使洞察生物体的新陈代谢。曼尼托盐Agar抑制对高盐敏感的生物体的生长。革兰氏阴性细菌通常无法存活，但克氏阳性葡萄球菌属能够茁壮成长。此外，MSA琼脂表示任何菌落能够发酵曼尼醇，因为发酵的酸副产品将介质中的甲基红色指示器变为亮黄色。这可以允许更具体的物种选择。
另一种常见的浓缩介质，Eosin亚甲蓝，含有eosin和亚甲蓝染料，对克阳性生物有毒。它还含有乳糖和细菌在这些板，可以发酵这将产生酸，降低pH，鼓励染料吸收。这些菌落占用大量的色素，并出现黑暗和金属。在这个实验室中，您将在三种不同的介质条件下生长四种不同的测试生物，然后在有氧与厌氧条件下生长，然后观察它们的发展。
在开始实验之前，请彻底洗手并擦干，然后戴上适当尺寸的实验室手套。然后用5%的漂白剂对工作面进行消毒，彻底擦拭。接下来，采取无菌接种回路，并将其处理到一个空的125毫升烧瓶，以便它不接触工作台表面。然后，从冰箱中收集四盘曼尼托盐Agar，或MSA，四盘Eosin甲基蓝琼烷，EMB，和八个试吃大豆Agar，或TSA，板。TSA介质是一种非选择性生长介质，将用于两种不同的环境条件。最后，在管架中收集您感兴趣的文化。在这里，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌表皮和蛋白石等将生长。
首先，点燃一个Bunsen燃烧器，用于对工具进行消毒。然后，将一个 MSA 板、一个 EMB 板和两个 TSA 板放在手边。然后，选择一种细菌培养物。您将用第一种文化为这四个板块接种。用你的自由手，拿起接种回路，然后在燃烧器的火焰中消毒，直到它发出橙色几秒钟。让回路在空气中冷却。然后，打开汤培养管，迅速火焰打开。将环浸入培养物中，然后将有机体条纹到第一个板的第一象限上。然后火焰再次消毒循环，并条纹第二象限。重复火焰灭菌的这个动作，然后条纹完成第三和第四象限。以这种方式进行破坏应能给孤立的殖民地，并允许确认文化没有受到污染。
现在，更换盖子，用细菌名称、介质类型、日期和首字母缩写标记板的底部。然后，对其余三个板中的每一个使用相同的细菌培养物重复条纹电镀，每次注意标记它们。现在，第一个培养基已经条纹，重复这些步骤，让其他细菌获得一个接种的MSA板，一个EMB板，和两个TSA板为每个物种。一旦所有生物体被转移，最后一次点燃环。
为了确定哪些生物可以在减少的氧气环境中生长，打开一个密封的气室系统，并在内部放置一组四个TSA细菌板。然后，将厌氧条件小袋放入腔室，并密封。最后，将所有板，包括密封气室系统内的板，放入37摄氏度的培养箱过夜。今后，每24至48小时检查一次板，给菌落时间生长和代谢任何指标反应物。
为了评估不同细菌物种对每种生长条件的反应如何，首先检查板块的生长情况，并记录哪些物种能够在每个介质类型和厌氧与有氧条件下产生菌落。注意生长的生物体的颜色以及菌落的大小和形状。
曼尼托盐琼脂培养基是选择性的克阳性生物，能够生存在6。5%氯化钠。在这个实验中，这意味着克阴性大肠杆菌和P.p.低度没有增长，由于高盐浓度。S. 表皮和 S. aureus 能够生长，但是，确认它们是克阳性。此外，这两个物种之间有明显的区别，因为由于发酵的酸副产品，S. aureus能够发酵曼尼醇，将介质中的甲基红色指示器变成亮黄色。这在S.表皮的案例中是看不到的。
另一方面，EMB介质对克阴性生物体是选择性的，因为eosin和亚甲蓝染料对克阳性细胞有毒。克氏阴性细菌的外膜阻止这些有毒染料进入细胞，这意味着它们能够生长。此外，这种培养基表明目前的细菌物种是否能够发酵乳糖。在这里，大肠杆菌菌落变成深紫色，有时与绿色金属光泽指示发酵。P. vulgaris生长在这种介质上，但不发酵乳糖，因此在染料的存在下出现浅粉色到紫色。在厌氧条件下，TSA介质上的细菌种类仍应生长，但与含氧量充足的细菌相比，可能增长得很差。这是因为没有一个试验物种是义务的厌食动物。
像这样的实验，以丰富生长环境可以帮助青睐和分离一个特定物种从混合样本。它们还有助于确定不同细菌物种在实验室环境中的最佳生长条件，从而有助于进一步研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
曼尼托盐阿加尔（MSA）：这种培养基对于能够在6.5%氯化钠中存活的克阳性生物体是选择性的。由于高盐浓度，克阴性生物大肠杆菌和蛋白石不应在这种介质上生长。S. 表皮和 S. aureus应该能够生长.介质是两者之间的差异，因为S.aureus能够发酵曼尼醇 - 使甲基红色指示亮黄色，由于酸作为发酵副产品的生产。S. 表皮米应保持板上的粉红色。
注：如果菌落很小，这种介质的生长可能需要在最佳温度下额外孵育长达48小时 - 这里为37°C。
Eosin M乙蓝琼脂 （EMB）：这种介质是克阴性生物选择性的， 所以大肠杆菌和Proteus 低俗板应该表现出生长.eosin和亚甲蓝染料对克阳性细胞有毒，因此链球菌物种都不应生长。克阴性细胞的外膜阻止染料进入细胞。这种介质是差异的，因为它允许一个测试有机体发酵乳糖的能力。由于乳糖在介质中发酵，大肠杆菌变成明亮的紫色（如果培养足够长的时间，通常带有绿色金属光泽）。P. 粗糖，虽然能够生长，但不发酵乳糖（然而，它能够发酵其他糖）。
试穿大豆Agar （TSA）：这种媒介是非选择性的，所以所有的研究物种都应该生长。然而，比较有氧和厌氧条件，从气体包的板应显示较少的增长（和较小的殖民地）。这是因为在演示中生长的细菌中没有一个是强制性的航空器，但它们的最佳生长条件确实包括氧气。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
不同的细菌物种能够在不同的环境中生长，并能够使用不同的碳源作为产生能量的方法。在实验室中将这些培养物作为培养物处理时，了解正在使用的生长介质的组成部分并与细菌物种相匹配非常重要。科学家和诊断学家还可以利用不同的生化反应作为一种将不同物种与其他物种分离的方法，并作为在混合环境中区分和识别细菌的一种方式。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
- Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
- Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
- Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
- Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
- Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
- Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
- Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
- Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO2 for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
- Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
- de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
- Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)
