Overview
Fonte: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Dipartimento di Scienze Biologiche, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Le cellule procariotiche sono in grado di abitare quasi ogni ambiente su questo pianeta. Come regno, possiedono una grande diversità metabolica, che consente loro di utilizzare un'ampia varietà di molecole per la generazione di energia (1). Pertanto, quando si coltivano questi organismi in laboratorio, tutte le molecole necessarie e specifiche necessarie per produrre energia devono essere fornite nei mezzi di crescita. Mentre alcuni organismi sono metabolicamente diversi, altri sono in grado di sopravvivere in ambienti estremi come alte o basse temperature, pH alcalino e acido, ambienti ridotti o privi di ossigeno o ambienti contenenti sale elevato (2,3,4). Definiti "estremofili", questi organismi spesso richiedono questi ambienti intensi per proliferare. Quando gli scienziati cercano di coltivare tali organismi, i componenti dei media e le eventuali condizioni ambientali specifiche devono essere presi in considerazione per coltivare con successo gli organismi di interesse.
Gli scienziati sono in grado di coltivare organismi coltivabili in laboratorio perché comprendono i requisiti specifici di cui quelle specie hanno bisogno per crescere. Tuttavia, gli organismi coltivabili rappresentano meno dell'1% delle specie stimate sul pianeta (5). Gli organismi che abbiamo rilevato mediante sequenziamento genico ma che non sono in grado di crescere in laboratorio sono considerati incoltibili (6). In questo momento, non sappiamo abbastanza sul metabolismo e sulle condizioni di crescita di questi organismi per replicare il loro ambiente in laboratorio.
Gli organismi meticolosi si trovano da qualche parte tra i primi due. Questi organismi sono coltivabili, ma richiedono condizioni di crescita molto specifiche, come componenti specifici dei mezzi di crescita e / o condizioni di crescita specifiche. Due esempi di tali generi sono Neisseria sp. e Haemophilus sp., entrambi i quali richiedono globuli rossi parzialmente scomposti (noto anche come agar al cioccolato), nonché fattori di crescita specifici e un ambiente ricco di anidride carbonica (7). Senza tutti i componenti specifici richiesti, questi organismi non cresceranno affatto. Spesso, anche con tutte le loro esigenze, questi organismi crescono male.
A differenza delle cellule eucariotiche, che sono in grado di crescere solo in un ambiente aerobico o contenente ossigeno, le cellule procariotiche sono in grado di crescere anaerobamente utilizzando diverse vie di fermentazione per generare ampia energia (8). Altri procarioti preferiscono un ambiente microaerofilo, o a ridotto ossigeno, o anche un ambiente capnofilo o ad alta anidride carbonica (9). Questi organismi sono più difficili da arricchire, poiché l'atmosfera deve essere alterata. Gli scienziati che lavorano frequentemente con organismi sensibili a un ambiente ossigenato normalmente lavorano in una camera anaerobica e in un incubatore, dove un gas pesante e inerte come l'argon viene pompato per spostare l'ossigeno (10). Altri fanno uso di sistemi di pacchetti di gas sigillati convenzionalmente disponibili che utilizzano acqua per generare idrogeno e anidride carbonica, insieme a un catalizzatore come il palladio per rimuovere tutto l'ossigeno atmosferico. Questi kit disponibili in commercio possono creare una qualsiasi delle condizioni atmosferiche sopra menzionate (10).
Sia che si coltivi un agente patogeno per determinare una potenziale infezione o che si cerchi di identificare una specifica specie di batteri presenti in un ambiente naturale, esiste un problema. Nessuna specie batterica abita un habitat. I batteri vivono come comunità multicellulari ovunque, dalla pelle degli esseri umani agli oceani del nostro pianeta (11). Quando si tenta di isolare una specie di batteri, gli scienziati devono lavorare per escludere i numerosi altri organismi che abitano anche l'area isolata. Per questo motivo, i mezzi di crescita arricchiti per i batteri spesso svolgono due funzioni. Il primo è quello di rendere i media selettivi. Un agente selettivo impedirà ad alcune specie di crescere, pur non inibendo e spesso anche promuovendo altre a crescere (12). La seconda funzione degli ingredienti dei media può essere quella di lavorare come agenti differenziali. Tali agenti consentono l'identificazione di una particolare caratteristica biochimica di un organismo isolato. Accoppiando diversi mezzi selettivi e differenziali insieme a condizioni di crescita appropriate, scienziati e diagnostici sono in grado di identificare la presenza di specifiche specie batteriche da un particolare isolato.
Un esempio di mezzo selettivo e differenziale che aiuta nell'identificazione è nel caso dell'organismo clinicamente significativo Staphylococcus aureus. Questo organismo è tipicamente coltivato su mannitolo sale agar. Questo mezzo non solo seleziona solo gli organismi che possono vivere in un ambiente ad alto contenuto di sale, che includono alcuni gram positivi come lo Staphylococcus, ma inibisce anche tutti gli organismi sensibili al sale. Lo zucchero di mannitolo è il componente differenziale di questo mezzo. Di tutte le specie di Staphylococcus clinicamente significative, solo S. aureus è in grado di fermentare il mannitolo. Questa reazione di fermentazione produce acido come sottoprodotto che fa ingiallire l'indicatore rosso metile rosso nel mezzo. Altre specie di Staphylococcus (come lo Staphylococcus epidermidis)sebbene in grado di crescere, lasceranno i media di colore rosso.
Questo esercizio di laboratorio dimostra una corretta tecnica asettica, nonché una corretta inoculazione dei mezzi di crescita dal brodo. Introduce inoltre la crescita di organismi contaminanti comuni sui mezzi di arricchimento, l'uso di un sistema di coltura anaerobica a pacchetto di gas per batteri anaerobici e l'uso di diversi mezzi selettivi e differenziali per l'identificazione presuntiva di batteri gram positivi e gram-negativi.
Procedure
1. Preparazione
- Prima di iniziare, lavarsi accuratamente le mani e indossare guanti di dimensioni adeguate.
- Sterilizzare la superficie di lavoro con ipoclorito di sodio al 5% (candeggina) e asciugare accuratamente.
- Posizionare un anello di inoculazione in un pallone Erlenmeyer vuoto da 120 ml in modo che non tocchi il piano di lavoro.
2. Mezzi di crescita e culture
- Raccogli quattro piatti di Mannitol Salt Agar (MSA), Eosin Methylene blue agar (EMB) e otto agar di soia triptica (TSA) dal frigorifero (questi possono essere acquistati commercialmente).
- Posizionare le piastre sull'area di lavoro pulita.
- Raccogliere le seguenti colture di brodo: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidise Proteus vulgaris. Usare cautela: poiché si tratta di organismi aerobici, i cappucci dei tubi dovrebbero essere leggermente allentati.
- Posizionare tutte le colture in una griglia per provette sulla superficie di lavoro pulita.
3. Trasferimento di colture e incubazione
- Stare in piedi o sedersi alla panca con tutti i materiali a portata di mano.
- Per utilizzare la tecnica asettica per trasferire i batteri alla piastra, prima fiammare il cappio fino a quando non è arancione incandescente - e quindi lasciarlo raffreddare nell'aria.
- Mentre il cappio si raffredda, prendi la coltura di brodo di E. colie poi apri il cappuccio usando il mignolo.
- Fiammare rapidamente l'apertura del tubo. Ciò impedisce la contaminazione.
- Immergere il loop nel tubo e strisciare l'organismo sul primo quadrante di una piastra EMB.
- Dopo aver eseguito la prima striscia, fiamma il ciclo e quindi esegui una seconda striscia attraversando la prima striscia solo una o due volte. Ciò consentirà l'isolamento di una singola colonia e di determinare se vi è contaminazione.
- Ripeti questa operazione fino a quando tutti e quattro i quadranti della piastra non sono stati striati.
- Ora, trasferire ciascuno degli altri quattro organismi nello stesso modo di placcatura a strisce in modo che il prodotto finale sia una piastra MSA, una piastra EMB e due piastre TSA separate per organismo.
- Una volta che tutti gli organismi sono stati trasferiti, fiamma il loop un'ultima volta e mettilo via.
- Posizionare 1 piastra TSA con ciascun organismo nella confezione di gas, quindi agitare una bustina di gas prima di metterla nella camera accanto alle piastre. Sigillare saldamente.
- Incubare tutte le piastre a 37°C durante la notte.
- Sterilizzare il piano di lavoro un'ultima volta con il 5% di candeggina.
4. Lettura e registrazione dei risultati
- Rimuovere le piastre dall'incubatore e posizionarle su un banco da laboratorio pulito
- Prendi nota della crescita degli organismi su ogni piastra nel tuo quaderno di laboratorio. In particolare, prendi appunti dettagliati su:
- Numero e dimensione delle colonie (se presenti) su ciascuna piastra, per ogni ceppo placcato
- Aspetto dell'agar che circonda qualsiasi colonia che cresce sulle placche MSA
- Aspetto di eventuali colonie che crescono sulle piastre EMB
- Differenze nella crescita tra le piastre TSA coltivate all'esterno rispetto all'interno del pacchetto di gas
I batteri sono in grado di abitare quasi tutti gli ambienti della Terra, dalla tundra del deserto alle foreste pluviali tropicali. Questa capacità di colonizzare nicchie molto diverse è dovuta alla loro adattabilità e alla vasta diversità metabolica, che consente loro di utilizzare un'ampia varietà di molecole per la generazione di energia. È questa enorme varietà di diversità che porta al fenomeno che meno dell'1% delle specie batteriche sul pianeta sono considerate coltivabili e queste sono possibili solo grazie alla comprensione delle loro specifiche esigenze metaboliche e ambientali.
L'esecuzione di manipolazioni dei media e dell'ambiente in laboratorio non solo consente ai ricercatori di sperimentare per trovare le condizioni ottimali per la coltivazione di una specie di interesse, ma consente anche l'arricchimento, il processo di cambiamento delle condizioni per selezionare specie specifiche da una cultura mista. Alcune specie microbiche sono generaliste e in grado di tollerare un'ampia varietà di stati o ambienti. Tali organismi possono crescere facilmente in condizioni di laboratorio, ma possono anche essere impediti di crescere se viene dato un habitat estremo - che può aiutare se l'obiettivo è quello di arricchire gli organismi di una coltura mista che sono tolleranti a questa condizione.
Gli organismi meticolosi possono essere coltivabili, ma solo quando sono soddisfatte condizioni specifiche. Le specie Neisseria o Haemophilus, ad esempio, richiedono mezzi contenenti globuli rossi parzialmente scomposti e un'alta concentrazione di anidride carbonica, che può anche scoraggiare la crescita di altre specie. Gli estremofili prendono il nome dalla loro preferenza per condizioni estreme, come temperature molto basse o alte, condizioni ridotte o di assenza di ossigeno o in presenza di sale alto. Queste condizioni sono probabilmente intollerabili per la maggior parte degli altri microbi.
Per arricchire ulteriormente un organismo di interesse, alcuni tipi di media contengono indicatori che forniscono informazioni sul metabolismo dell'organismo. Mannitolo Sale Agar inibisce la crescita di organismi sensibili al sale alto. I batteri Gram negativi in genere non possono sopravvivere, ma il genere Staphylococcus gram positivo è in grado di prosperare. Inoltre, l'agar MSA indica eventuali colonie in grado di fermentare il mannitolo perché i sottoprodotti acidi della fermentazione trasformeranno l'indicatore rosso metile nel mezzo in un giallo brillante. Ciò può consentire una selezione più specifica di una specie.
Un altro mezzo di arricchimento comune, Eosin Methylene Blue, contiene coloranti blu di eosina e metilene, che sono tossici per gli organismi gram positivi. Contiene anche lattosio e batteri su queste piastre che possono fermentare questo produrrà acidi che abbassano il pH incoraggiando l'assorbimento del colorante. Queste colonie occupano grandi quantità di pigmento e appaiono scure e metalliche. In questo laboratorio, coltiverai quattro diversi organismi di prova in tre diverse condizioni mediatiche e poi in condizioni aerobiche rispetto a quelle anaerobiche prima di osservarne lo sviluppo.
Prima di iniziare l'esperimento, lavarsi accuratamente le mani e asciugarle, prima di indossare guanti da laboratorio di dimensioni adeguate. Quindi, sterilizzare la superficie di lavoro con candeggina al 5%, pulendola accuratamente. Quindi, prendi un anello di inoculazione sterile e posizionalo in un matraccio vuoto da 125 millilitro in modo che non tocchi la superficie del banco. Quindi, dal frigorifero, raccogliere quattro piatti di Mannitol Salt Agar, o MSA, quattro piatti di Agar blu di metilene Eosina, EMB e otto piastre di agar di soia triptica, o TSA. Il mezzo TSA è un mezzo di crescita non selettivo che verrà utilizzato per le due diverse condizioni ambientali. Infine, riunisci le tue culture di interesse in un portatubi. Qui verranno coltivati Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidee Proteus vulgaris.
Per iniziare, accendi un bruciatore Bunsen, che verrà utilizzato per sterilizzare gli strumenti. Quindi, posizionare una piastra MSA, una piastra EMB e due piastre TSA a portata di mano. Quindi, selezionare una delle colture batteriche. Inocularai tutti e quattro questi piatti con la prima cultura. Con la mano libera, raccogli il cappio di inoculazione e poi sterilizzalo nella fiamma del bruciatore fino a quando non si illumina di arancione per un paio di secondi. Lasciare raffreddare il loop nell'aria. Quindi, aprire il tubo di coltura del brodo e fiammare rapidamente l'apertura. Immergere il ciclo nella coltura e quindi strisciare l'organismo sul primo quadrante della prima piastra. Quindi la fiamma sterilizza di nuovo il cappio e striscia il secondo quadrante. Ripetere questa azione di sterilizzazione a fiamma e poi striature per completare il terzo e il quarto quadrante. La steatura in questo modo dovrebbe dare colonie isolate e anche consentire la conferma che la cultura non è contaminata.
Ora, sostituisci il coperchio ed etichetta il fondo della piastra con il nome dei batteri, il tipo di supporto, la data e le tue iniziali. Quindi, ripetere la placcatura a strisce utilizzando la stessa coltura batterica per ciascuna delle restanti tre piastre avendo cura di etichettarle ogni volta. Ora che la prima coltura è stata striata, ripetere questi passaggi per gli altri batteri per ottenere una piastra MSA inoculata, una piastra EMB e due piastre TSA per ogni specie. Una volta che tutti gli organismi sono stati trasferiti, fiamma il loop un'ultima volta.
Per determinare quali organismi possono crescere in un ambiente a ossigeno ridotto, aprire un sistema di camere a gas sigillate e posizionare un set di quattro piastre batteriche TSA all'interno. Quindi, posizionare una bustina di condizione anaerobica nella camera e sigillarla ermeticamente. Infine, posizionare tutte le piastre, comprese quelle all'interno del sistema di camere a gas sigillate, in un incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Andando avanti, controlla le piastre ogni 24-48 ore per dare alle colonie il tempo di crescere e metabolizzare eventuali reagenti indicatori.
Per valutare quanto bene le diverse specie batteriche hanno risposto a ciascuna condizione di crescita, esaminare prima le piastre per la crescita e registrare quali specie sono state in grado di produrre colonie su ciascun tipo di mezzo e nella condizione anaerobica rispetto a quella aerobica. Nota il colore degli organismi che crescono, nonché le dimensioni e la forma delle colonie.
Il mezzo di agar sale di mannitolo è selettivo per gli organismi gram positivi che sono in grado di sopravvivere in 6. Cloruro di sodio al 5%. In questo esperimento, ciò significava che il gram negativo E. coli e P. vulgaris non crescevano a causa delle alte concentrazioni di sale. S. epidermide e S. aureus sono stati in grado di crescere, tuttavia, confermando che sono gram positivi. Inoltre, c'è una chiara differenza tra le due specie perché il S. aureus è in grado di fermentare il mannitolo trasformando l'indicatore rosso metile nel mezzo in un giallo brillante a causa dei sottoprodotti acidi della fermentazione. Questo non è stato visto nel caso di S. epidermide.
Il mezzo EMB d'altra parte è selettivo per gli organismi gram negativi perché i coloranti blu di eosina e metilene sono tossici per le cellule gram positive. La membrana esterna dei batteri gram negativi impedisce a questi coloranti tossici di entrare nelle cellule, il che significa che sono in grado di crescere. Inoltre, questo mezzo indica se la specie batterica presente è in grado di fermentare il lattosio. Qui, le colonie di E. coli diventano di un colore viola scuro, a volte con una lucentezza metallica verde che indica la fermentazione. P. vulgaris cresce su questo mezzo ma non fermenta il lattosio e così appare di un rosato chiaro al viola dall'essere in presenza del colorante. Nella condizione anaerobica, le specie batteriche sui mezzi TSA dovrebbero ancora crescere, ma possono farlo molto male rispetto a quelle con abbondante ossigeno. Questo perché nessuna delle specie di test è anaerobes obbligata.
Esperimenti come questo per arricchire l'ambiente di crescita possono aiutare a favorire e isolare una specie specifica da un campione misto. Possono anche aiutare a determinare le condizioni di crescita ottimali per diverse specie batteriche in un ambiente di laboratorio, aiutando così ulteriori ricerche.
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Results
Mannitolo Sale Agar (MSA): Questo mezzo è selettivo per gli organismi gram positivi che sono in grado di sopravvivere nel 6,5% di cloruro di sodio. Gli organismi gram-negativi Escherichia coli e Proteus vulgaris non dovrebbero essere in grado di crescere su questo mezzo a causa dell'alta concentrazione di sale. S. epidermidis e S. aureus dovrebbero essere in grado di crescere. Il mezzo è differenziale tra i due perché il S. aureus è in grado di fermentare il mannitolo - trasformando l'indicatore rosso metile in giallo brillante a causa della produzione di acido come sottoprodotto della fermentazione. S. epidermidis dovrebbe mantenere il colore rosa sul piatto.
NOTA BENE: Se le colonie sono piccole, la crescita su questo mezzo può richiedere un'ulteriore incubazione per un totale fino a 48 ore a temperatura ottimale - qui, 37 ° C.
Eosin Methylene Blue agar (EMB): Questo mezzo è selettivo per gli organismi gram negativi, quindi le placche Escherichia coli e Proteus vulgaris dovrebbero mostrare crescita. I coloranti blu di eosina e metilene sono tossici per le cellule gram positive, quindi nessuna delle due specie di streptococco dovrebbe crescere. La membrana esterna delle cellule gram-negative impedisce ai coloranti di entrare nelle cellule. Questo mezzo è differenziale perché consente di testare la capacità dell'organismo di fermentare il lattosio. E. coli diventa di un colore viola brillante (spesso con una lucentezza metallica verde se coltivata abbastanza a lungo) a causa della fermentazione del lattosio nei media. Il P. vulgaris,pur in grado di crescere, non fermenta il lattosio (tuttavia è in grado di fermentare altri zuccheri).
Agar di soia triptica (TSA): Questo mezzo non è selettivo, quindi tutte le specie di studio dovrebbero crescere. Tuttavia, confrontando le condizioni aerobiche rispetto a quelle anaerobiche, le piastre del pacchetto di gas dovrebbero mostrare meno crescita (e colonie più piccole). Questo perché nessuno dei batteri cresciuti nella dimostrazione sono aerobi obbligati, ma la loro condizione di crescita ottimale include l'ossigeno.
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Applications and Summary
Diverse specie batteriche sono in grado di crescere in ambienti diversi e sono in grado di utilizzare diverse fonti di carbonio come un modo per generare energia. Quando si lavora con queste colture in laboratorio, è importante conoscere i componenti dei mezzi di crescita con cui si lavora e abbinare i mezzi di crescita alle specie batteriche. Scienziati e diagnostici possono anche sfruttare le diverse reazioni biochimiche come un modo per isolare specie diverse dalle altre e come un modo per distinguere e identificare i batteri in un ambiente misto.
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