Overview
Fonte: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Células procarióticas são capazes de habitar quase todos os ambientes deste planeta. Como um reino, eles possuem uma grande diversidade metabólica, permitindo-lhes usar uma grande variedade de moléculas para geração de energia (1). Portanto, ao cultivar esses organismos em laboratório, todas as moléculas necessárias e específicas necessárias para fazer energia devem ser fornecidas na mídia de crescimento. Enquanto alguns organismos são metabolicamente diversos, outros são capazes de sobreviver em ambientes extremos, como altas ou baixas temperaturas, pH alcalino e ácido, ambientes reduzidos ou ausentes de oxigênio, ou ambientes que contenham sal alto (2,3,4). Denominados de "extremófilos", esses organismos muitas vezes requerem que esses ambientes intensos se proliferem. Quando os cientistas procuram cultivar tais organismos, os componentes da mídia, bem como quaisquer condições ambientais específicas, todos precisam ser levados em conta para cultivar com sucesso os organismos de interesse.
Os cientistas são capazes de cultivar organismos culturais em laboratório porque entendem os requisitos específicos que essas espécies precisam para crescer. No entanto, os organismos culturaláveis representam menos de 1% das espécies estimadas no planeta (5). Organismos que detectamos por sequenciamento genético, mas que não são capazes de crescer em laboratório são considerados não culturais (6). Neste momento, não sabemos o suficiente sobre o metabolismo e as condições de crescimento desses organismos para replicar seu ambiente em laboratório.
Organismos exigentes estão em algum lugar entre os dois primeiros. Esses organismos são culturaáveis, mas requerem condições de crescimento muito específicas, como componentes específicos da mídia de crescimento e/ou condições específicas de crescimento. Dois exemplos desse gênero são Neisseria sp. e Haemophilus sp., ambos requerem glóbulos vermelhos parcialmente quebrados (também conhecidos como ágar de chocolate), bem como fatores específicos de crescimento e um ambiente rico em dióxido de carbono (7). Sem todos os componentes específicos necessários, esses organismos não crescerão. Muitas vezes, mesmo com todas as suas exigências, esses organismos crescem mal.
Ao contrário das células eucarióticas, que só são capazes de crescer em um ambiente aeróbico, ou contendo oxigênio, as células procarióticas são capazes de crescer anaerobicamente usando várias vias de fermentação para gerar energia ampla (8). Outros procariotes preferem um ambiente microaerofílico, ou oxigênio reduzido, ou mesmo um ambiente capnofílico ou de dióxido de carbono alto (9). Esses organismos são mais desafiadores para enriquecer, já que a atmosfera deve ser alterada. Cientistas que frequentemente trabalham com organismos sensíveis a um ambiente oxigenado normalmente trabalhariam em uma câmara anaeróbica e incubadora, onde um gás pesado e inerte como o argônio é bombeado para deslocar o oxigênio (10). Outros fazem uso de sistemas de pacotes de gás selados convencionalmente disponíveis que usam água para gerar hidrogênio e dióxido de carbono, juntamente com um catalisador como o paládio para remover todo o oxigênio atmosférico. Estes kits disponíveis comercialmente podem criar qualquer uma das condições atmosféricas acima mencionadas (10).
Seja cultivando um patógeno para determinar uma infecção potencial ou procurando identificar uma espécie específica de bactérias presentes em um ambiente natural, existe um problema. Nenhuma espécie bacteriana habita um habitat. As bactérias vivem como comunidades multicelulares em todos os lugares, desde a pele dos humanos até os oceanos do nosso planeta (11). Ao tentar isolar uma espécie de bactéria, os cientistas devem trabalhar para excluir os inúmeros outros organismos que também estão habitando a área isolada. Por essa razão, a mídia de crescimento enriquecida para bactérias muitas vezes realiza duas funções. A primeira é tornar a mídia seletiva. Um agente seletivo impedirá que algumas espécies cresçam, sem inibir e muitas vezes até mesmo promover outras para crescer (12). A segunda função dos ingredientes da mídia pode ser trabalhar como agentes diferenciais. Tais agentes permitem a identificação de uma característica bioquímica particular de um organismo isolado. Ao associar várias mídias seletivas e diferenciais diferentes, juntamente com condições adequadas de crescimento, cientistas e diagnósticos são capazes de identificar a presença de espécies bacterianas específicas de um determinado isolado.
Um exemplo de mídia seletiva e diferencial auxiliando na identificação é no caso do organismo clinicamente significativo Staphylococcus aureus. Este organismo é tipicamente cultivado em ágar de sal manitol. Esta mídia não só seleciona para organismos que podem viver em um ambiente de sal alto, que incluem alguns gram positivos como o Staphylococcus,mas também inibe quaisquer organismos sensíveis ao sal. O açúcar mannitol é o componente diferencial deste meio. De todas as espécies de Staphylococcus clinicamente significativas, apenas S. aureus é capaz de fermentar manitol. Esta reação de fermentação produz ácido como um subproduto que faz com que o indicador vermelho metil vermelho na mídia se transforme em amarelo. Outras espécies de Staphylococcus (como Staphylococcus epidermidis), embora capazes de crescer, deixarão a mídia vermelha na cor.
Este exercício de laboratório demonstra técnica asséptica adequada, bem como a inoculação adequada da mídia de crescimento a partir do caldo. Também introduz o crescimento de organismos contaminantes comuns em meios de enriquecimento, o uso de um sistema de cultura anaeróbica de pacotes gasosos para bactérias anaeróbicas e o uso de diferentes mídias seletivas e diferenciais para a identificação presuntiva de bactérias gram positivas e gram-negativas.
Procedure
1. Preparação
- Antes de começar, lave bem as mãos e coloque luvas de tamanho adequado.
- Esterilizar a superfície de trabalho com hipoclorito de sódio de 5% (alvejante) e secar completamente.
- Coloque um laço inoculante em um frasco vazio de 120 mL Erlenmeyer para que ele não toque na parte superior do banco durante o trabalho.
2. Growth Media and Cultures
- Reúna quatro pratos de Mannitol Salt Agar (MSA), ágar azul de metilaeno Eosin (EMB) e oito ágar de soja tripptic (TSA) da geladeira (estes podem ser comprados comercialmente).
- Coloque placas na área de trabalho limpa.
- Junte as seguintes culturas de caldo: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidise Proteus vulgaris. Tenha cuidado: como se trata de organismos aeróbicos, as tampas dos tubos devem estar ligeiramente soltas.
- Coloque todas as culturas em um rack de tubo de ensaio na superfície de trabalho limpa.
3. Transferir culturas e incubação
- Fique ou sente-se no banco com todos os materiais ao alcance.
- Para usar a técnica asséptica para transferir as bactérias para a placa, primeiro flameja o laço até que esteja brilhando laranja - e, em seguida, deixe esfriar no ar.
- Enquanto o laço esfria, pegue a cultura do caldo de E. coli,e depois abra a tampa usando seu dedo mindinho.
- Inflamar a abertura do tubo rapidamente. Isso evita a contaminação.
- Mergulhe o laço no tubo e coloque o organismo no primeiro quadrante de uma placa EMB.
- Após a primeira raia ser realizada, flame o loop, e depois executar uma segunda raia cruzando a primeira raia apenas uma ou duas vezes. Isso permitirá o isolamento de uma única colônia e determinará se há alguma contaminação.
- Repita isso até que todos os quatro quadrantes da placa tenham sido listrados.
- Agora, transfira cada um dos outros quatro organismos da mesma maneira de chapeamento de raia para que o produto final seja uma placa MSA, uma placa EMB, e duas placas TSA separadas por organismo.
- Uma vez que todos os organismos foram transferidos, inflamar o laço uma última vez e colocá-lo fora.
- Coloque 1 placa TSA com cada organismo no pacote de gás e, em seguida, agite um sachê de gás antes de colocá-lo na câmara ao lado das placas. Selar firmemente.
- Incubar todas as placas a 37°C durante a noite.
- Esterilize a superfície de trabalho uma última vez com 5% de alvejante.
4. Resultados de leitura e gravação
- Remova as placas da incubadora e coloque-as em um banco de laboratório limpo
- Tome nota do crescimento a partir dos organismos em cada placa em seu caderno de laboratório. Em particular, tome notas detalhadas sobre:
- Números e tamanho das colônias (se presentes) em cada placa, para cada cepa banhada
- Aparência do ágar em torno de quaisquer colônias crescendo nas placas msa
- Aparência de quaisquer colônias crescendo nas placas emb
- Diferenças no crescimento entre as placas TSA cultivadas fora versus dentro do pacote de gás
As bactérias são capazes de habitar quase todos os ambientes da Terra, desde tundras do deserto até florestas tropicais. Essa capacidade de colonizar nichos muito diferentes deve-se à sua adaptabilidade e vasta diversidade metabólica, o que lhes permite utilizar uma grande variedade de moléculas para geração de energia. É essa enorme gama de diversidade que leva ao fenômeno que menos de 1% das espécies bacterianas do planeta são consideradas culturais e estas só são possíveis devido ao entendimento de suas necessidades metabólicas e ambientais específicas.
A realização de manipulações de mídia e meio ambiente em laboratório não só permite que os pesquisadores experimentem as condições ideais para cultivar uma espécie de interesse, mas também permite o enriquecimento, o processo de mudança de condições para selecionar para espécies específicas de uma cultura mista. Algumas espécies microbianas são generalistas e capazes de tolerar uma grande variedade de estados ou ambientes. Tais organismos podem crescer prontamente em condições laboratoriais, mas também podem ser impedidos de crescer se for dado um habitat extremo - o que pode ajudar se o objetivo é enriquecer para organismos de uma cultura mista que são tolerantes a essa condição.
Organismos exigentes podem ser culturados, mas somente quando condições específicas são atendidas. As espécies de Neisseria ou Haemophilus, por exemplo, requerem mídia contendo glóbulos vermelhos parcialmente quebrados e uma alta concentração de dióxido de carbono, o que também pode desencorajar o crescimento de outras espécies. Os extremófilos são nomeados por sua preferência por condições extremas, como temperaturas muito baixas ou altas, condições reduzidas ou sem oxigênio, ou na presença de sal alto. Essas condições são provavelmente intoleráveis para a maioria dos outros micróbios.
Para enriquecer ainda mais para um organismo de interesse, alguns tipos de mídia contêm indicadores que dão uma visão do metabolismo do organismo. Mannitol Salt Agar inibe o crescimento de organismos sensíveis ao sal alto. As bactérias gram negativas normalmente não podem sobreviver, mas o gênero Staphylococcus gram positivo é capaz de prosperar. Além disso, o ágar MSA indica quaisquer colônias capazes de fermentar mannitol porque os subprodutos ácidos da fermentação transformarão o indicador vermelho metil na mídia para um amarelo brilhante. Isso pode permitir uma seleção mais específica de uma espécie.
Outro meio de enriquecimento comum, o Eosin Metilene Blue, contém corantes azuis de eosina e metileno, que são tóxicos para organismos gram positivos. Também contém lactose e bactérias nessas placas que podem fermentar isso produzirá ácidos que reduzem o pH incentivando a absorção de corantes. Essas colônias tomam grandes quantidades de pigmento e parecem escuras e metálicas. Neste laboratório, você crescerá quatro organismos de teste diferentes em três condições diferentes de mídia e, em seguida, sob condições aeróbicas versus anaeróbicas antes de observar seu desenvolvimento.
Antes de começar o experimento, lave bem as mãos e seque-as adequadamente, antes de colocar luvas de laboratório de tamanho adequado. Em seguida, esterilize a superfície de trabalho com 5% de alvejante, limpando-a completamente. Em seguida, pegue um laço inoculante estéril e coloque-o para baixo em um frasco vazio de 125 mililitros para que ele não toque na superfície do banco. Em seguida, da geladeira, reúna quatro pratos de Mannitol Salt Agar, ou MSA, quatro pratos de ágar azul de metilaeno Eosin, EMB, e oito ágar de soja tryptic, ou TSA, placas. O meio TSA é um meio de crescimento não seletivo que será utilizado para as duas condições ambientais diferentes. Finalmente, reúna suas culturas de interesse em um rack de tubos. Aqui, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermise Proteus vulgaris serão cultivados.
Para começar, acenda um queimador Bunsen, que será usado para esterilizar as ferramentas. Em seguida, coloque uma placa MSA, uma placa EMB e duas placas TSA próximas à mão. Então, selecione uma das culturas bacterianas. Você vai vacinar todas as quatro placas com a primeira cultura. Com a sua mão livre, pegue o laço inoculante e, em seguida, esterilize-o na chama do queimador até que ele brilhe laranja por alguns segundos. Deixe o loop esfriar no ar. Em seguida, abra o tubo de cultura do caldo e desade a abertura rapidamente. Mergulhe o laço na cultura e, em seguida, listrar o organismo no primeiro quadrante da primeira placa. Em seguida, a chama esterilizar o laço novamente e listrar o segundo quadrante. Repita esta ação de esterilização de chamas e, em seguida, streaking para completar o terceiro e quarto quadrantes. A estria dessa forma deve dar colônias isoladas e também permitir a confirmação de que a cultura não está contaminada.
Agora, substitua a tampa e rotule a parte inferior da placa com o nome da bactéria, tipo de mídia, data e suas iniciais. Em seguida, repita o revestimento de raia usando a mesma cultura bacteriana para cada uma das três placas restantes, tomando o cuidado de rotulá-las cada vez. Agora que a primeira cultura foi listrada, repita esses passos para que as outras bactérias obtenham uma placa MSA inoculada, uma placa EMB e duas placas TSA para cada espécie. Uma vez que todos os organismos foram transferidos, inflamar o laço uma última vez.
Para determinar quais organismos podem crescer em um ambiente de oxigênio reduzido, abra um sistema de câmara de gás selado e coloque um conjunto de quatro placas de bactérias TSA dentro. Em seguida, coloque um sachê de condição anaeróbica na câmara e seque-a firmemente. Finalmente, coloque todas as placas, incluindo aquelas dentro do sistema de câmara de gás selada, em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite. Daqui para frente, verifique as placas a cada 24 a 48 horas para dar às colônias tempo para crescer e metabolizar qualquer indicador reagente.
Para avaliar o quão bem as diferentes espécies bacterianas responderam a cada condição de crescimento, primeiro examine as placas para crescimento e regisine quais espécies foram capazes de produzir colônias em cada tipo de mídia e na condição anaeróbica versus aeróbica. Note a cor dos organismos crescendo, bem como os tamanhos e forma das colônias.
O mannitol salt agar médio é seletivo para organismos gram positivos que são capazes de sobreviver em 6. 5% de cloreto de sódio. Neste experimento, isso significava que os gram negativos E. coli e P. vulgaris não cresceram devido às altas concentrações de sal. S. epiderme e S. aureus foram capazes de crescer, no entanto, confirmando que eles são gram positivos. Além disso, há uma clara diferença entre as duas espécies porque o S. aureus é capaz de fermentar manitol transformando o indicador vermelho metil na mídia em um amarelo brilhante devido aos subprodutos ácidos da fermentação. Isso não foi visto no caso da S. epiderme.
O meio EMB, por outro lado, é seletivo para organismos gram negativos porque os corantes azuis de eosina e metileno são tóxicos para células gram positivas. A membrana externa das bactérias gram negativas impede que esses corantes tóxicos entrem nas células, o que significa que eles são capazes de crescer. Além disso, este meio indica se as espécies bacterianas presentes são capazes de fermentar lactose. Aqui, as colônias E. coli tornam uma cor roxa escura, às vezes com um brilho metálico verde indicando fermentação. P. vulgaris cresce neste meio, mas não fermenta lactose e assim aparece um rosado claro para roxo de estar na presença do corante. Na condição anaeróbica, as espécies bacterianas na mídia TSA ainda devem crescer, mas podem fazê-lo muito mal em comparação com aquelas com amplo oxigênio. Isso porque nenhuma das espécies de teste são anaerobes obrigatórias.
Experimentos como este para enriquecer o ambiente de crescimento podem ajudar a favorecer e isolar uma espécie específica de uma amostra mista. Eles também podem ajudar a determinar as condições ideais de crescimento para diferentes espécies bacterianas em um ambiente de laboratório, auxiliando assim novas pesquisas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Mannitol Salt Agar (MSA): Este meio é seletivo para organismos gram positivos que são capazes de sobreviver em 6,5% de cloreto de sódio. Os organismos gram-negativos Escherichia coli e Proteus vulgaris não devem ser capazes de crescer neste meio por causa da alta concentração de sal. S. epidermidis e S. aureus devem ser capazes de crescer. A mídia é diferencial entre os dois porque o S. aureus é capaz de fermentar o mannitol - transformando o indicador vermelho metil amarelo brilhante devido à produção de ácido como subproduto de fermentação. S. epidermidis deve manter a cor rosa na placa.
NOTA: Se as colônias forem pequenas, o crescimento neste meio pode exigir incubação adicional por um total de até 48 horas a temperatura ideal - aqui, 37°C.
Eosin Metileno Ágar azul (EMB): Este meio é seletivo para organismos gram negativos, por isso as placas Escherichia coli e Proteus vulgaris devem apresentar crescimento. Os corantes azuis de eosina e metileno são tóxicos para gram células positivas, então nenhuma espécie de Streptococcus deve crescer. A membrana externa das células gram-negativas impede que os corantes entrem nas células. Esta mídia é diferencial porque permite que se teste para a capacidade do organismo de fermentar lactose. E. coli transforma uma cor roxa brilhante (muitas vezes com um brilho metálico verde se cultivado por tempo suficiente) devido à fermentação da lactose na mídia. O P. vulgaris, embora capaz de crescer, não fermenta lactose (porém é capaz de fermentar outros açúcares).
Agar de soja tripptic (TSA): Este meio não é seletivo, por isso todas as espécies de estudo devem crescer. No entanto, comparando as condições aeróbicas versus anaeróbicas, as placas da embalagem de gás devem apresentar menos crescimento (e colônias menores). Isso ocorre porque nenhuma das bactérias cultivadas na demonstração são aerobes obrigatórios, mas sua condição de crescimento ideal inclui oxigênio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Diferentes espécies bacterianas são capazes de crescer em diferentes ambientes e são capazes de usar diferentes fontes de carbono como forma de gerar energia. Ao trabalhar com essas culturas no laboratório, é importante conhecer os componentes da mídia de crescimento que está sendo trabalhada e combinar a mídia de crescimento com as espécies bacterianas. Cientistas e diagnósticos também podem explorar as diferentes reações bioquímicas como uma maneira de isolar diferentes espécies das outras e como uma maneira de distinguir e identificar bactérias em um ambiente misto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
- Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
- Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
- Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
- Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
- Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
- Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
- Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
- Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO2 for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
- Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
- de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
- Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)
