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Anreicherungskulturen: Kultivieren von aeroben und anaeroben Mikroben auf selektiven und differenziellen Medien

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Bakterien sind in der Lage, fast jede Umgebung auf der Erde zu bewohnen, von Wüstentundra bis zu tropischen Regenwäldern. Diese Fähigkeit, sehr unterschiedliche Nischen zu kolonisieren, ist auf ihre Anpassungsfähigkeit und enorme metabolische Vielfalt zurückzuführen, die es ihnen ermöglicht, eine Vielzahl von Molekülen für die Energieerzeugung zu nutzen. Es ist diese massive Vielfalt, die zu dem Phänomen führt, dass weniger als 1% der Bakterienarten auf dem Planeten als kultivierbar gelten und diese nur aufgrund eines Verständnisses ihrer spezifischen metabolischen und ökologischen Bedürfnisse möglich sind.

Die Durchführung von Manipulationen von Medien und Umwelt im Labor ermöglicht es Forschern nicht nur, zu experimentieren, um die optimalen Bedingungen für die Kultivierung einer Art von Interesse zu finden, sondern ermöglicht auch die Anreicherung, den Prozess der Veränderung der Bedingungen für die Auswahl für spezifische Arten aus einer Gemischten Kultur. Einige mikrobielle Arten sind Generalisten und in der Lage, eine Vielzahl von Staaten oder Umgebungen zu tolerieren. Solche Organismen können unter Laborbedingungen leicht wachsen, aber sie können auch daran gehindert werden, zu wachsen, wenn ihnen ein extremer Lebensraum gegeben wird - was helfen kann, wenn das Ziel darin besteht, sich für Organismen aus einer gemischten Kultur zu bereichern, die diesem Zustand gegenüber tolerant sind.

Schnelle Organismen können kultivierbar sein, aber nur, wenn bestimmte Bedingungen erfüllt sind. Neisseria- oder Haemophilus-Arten benötigen beispielsweise Medien, die teilweise abgebaute rote Blutkörperchen und eine hohe Kohlendioxidkonzentration enthalten, was auch das Wachstum anderer Arten abschrecken kann. Extremophile sind nach ihrer Vorliebe für extreme Bedingungen, wie sehr niedrige oder hohe Temperaturen, reduzierte oder Sauerstoff mangelende Bedingungen, oder in Gegenwart von hohem Salz benannt. Diese Bedingungen sind für die meisten anderen Mikroben wahrscheinlich unerträglich.

Um einen Organismus von Interesse weiter anzureichern, enthalten einige Medientypen Indikatoren, die Einblicke in den Stoffwechsel des Organismus geben. Mannitol Salz Agar hemmt das Wachstum von Organismen empfindlich auf hohe Salz. Gram negative Bakterien in der Regel nicht überleben, aber die gram positive Staphylococcus Gattung sind in der Lage zu gedeihen. Darüber hinaus zeigt der MSA-Agar alle Kolonien an, die Mannitol fermentieren können, da die sauren Nebenprodukte der Fermentation den Methylrotindikator in den Medien in ein helles Gelb verwandeln. Dies kann eine spezifischere Auswahl einer Art ermöglichen.

Ein weiteres gemeinsames Anreicherungsmedium, Eosin Methylenblau, enthält Eosin- und Methylenblaufarbstoffe, die für grampositive Organismen giftig sind. Es enthält auch Lactose und Bakterien auf diesen Platten, die dies fermentieren können, um Säuren zu produzieren, die den pH-Wert fördernde Farbstoffaufnahme senken. Diese Kolonien nehmen große Mengen an Pigment ein und erscheinen dunkel und metallisch. In diesem Labor wachsen Sie vier verschiedene Testorganismen unter drei verschiedenen Medienbedingungen und dann unter aeroben versus anaeroben Bedingungen, bevor Sie ihre Entwicklung beobachten.

Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, waschen Sie Ihre Hände gründlich und trocknen Sie sie, bevor Sie die entsprechend großen Laborhandschuhe anziehen. Dann sterilisieren Sie die Arbeitsfläche mit 5% Bleichmittel und wischen Sie sie gründlich ab. Als nächstes nehmen Sie eine sterile Impfschlaufe und legen Sie sie in einen leeren 125-Milliliter-Kolben, damit er die Bankoberfläche nicht berührt. Dann, aus dem Kühlschrank, sammeln vier Platten Von Mannitol Salt Agar, oder MSA, vier Platten von Eosin Methylen Blue Agar, EMB, und acht Tryptic Soy Agar, oder TSA, Platten. TSA-Medium ist ein nicht-selektives Wachstumsmedium, das für die beiden unterschiedlichen Umweltbedingungen verwendet wird. Schließlich sammeln Sie Ihre Kulturen des Interesses in einem Rohrregal. Hier werden Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermisund Proteus vulgaris angebaut.

Um zu beginnen, beleuchten Sie einen Bunsenbrenner, der verwendet wird, um die Werkzeuge zu sterilisieren. Legen Sie dann eine MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei TSA-Platten in der Nähe. Wählen Sie dann eine der Bakterienkulturen aus. Sie werden alle vier dieser Platten mit der ersten Kultur impfen. Mit Ihrer freien Hand, nehmen Sie die Impfschlaufe und dann sterilisieren Sie es in der Flamme des Brenners, bis es orange für ein paar Sekunden leuchtet. Lassen Sie die Schleife in der Luft abkühlen. Dann öffnen Sie die Brühe Kulturrohr und schnell flammen die Öffnung. Tauchen Sie die Schleife in die Kultur und streifen Sie dann den Organismus auf den ersten Quadranten der ersten Platte. Dann flammen Die Schleife wieder und streifen den zweiten Quadranten. Wiederholen Sie diese Aktion der Flammensterilisation und dann streifen, um den dritten und vierten Quadranten abzuschließen. Streaking auf diese Weise sollte isolierte Kolonien geben und auch die Bestätigung ermöglichen, dass die Kultur nicht kontaminiert ist.

Ersetzen Sie nun den Deckel und beschriften Sie den Boden der Platte durch den Namen der Bakterien, den Medientyp, das Datum und Ihre Initialen. Wiederholen Sie dann die Streifenbeschichtung mit der gleichen Bakterienkultur für jede der verbleibenden drei Platten, wobei Sie darauf achten, sie jedes Mal zu kennzeichnen. Nun, da die erste Kultur gestreift wurde, wiederholen Sie diese Schritte für die anderen Bakterien, um eine geimpfte MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei TSA-Platten für jede Art zu erhalten. Sobald alle Organismen übertragen sind, entzünden Sie die Schleife ein letztes Mal.

Um zu bestimmen, welche Organismen in einer reduzierten Sauerstoffumgebung wachsen können, öffnen Sie ein versiegeltes Gaskammersystem und platzieren Sie einen Satz von vier TSA-Bakterienplatten darin. Dann legen Sie einen anaeroben Zustandsbeutel in die Kammer und versiegeln Sie ihn fest. Schließlich legen Sie alle Platten, einschließlich der erborts im versiegelten Gaskammersystem, über Nacht in einen 37-Grad-Grad-Inkubator. In Zukunft überprüfen Sie die Platten alle 24 bis 48 Stunden, um den Kolonien Zeit zu geben, zu wachsen und alle Indikator-Reaktanten zu verstoffwechseln.

Um zu beurteilen, wie gut die verschiedenen Bakterienarten auf jede Wachstumsbedingung reagierten, untersuchen Sie zunächst die Platten auf Wachstum und erfassen Sie, welche Arten in der Lage waren, Kolonien auf jedem Medientyp und in der anaeroben versus aeroben Bedingung zu produzieren. Beachten Sie die Farbe der wachsenden Organismen sowie die Größe und Form der Kolonien.

Das Mannitol-Salz-Agar-Medium ist selektiv für grampositive Organismen, die in 6 überleben können. 5% Natriumchlorid. In diesem Experiment bedeutete dies, dass das Gramm negative E. coli und P. vulgaris aufgrund der hohen Salzkonzentrationen nicht wuchsen. S. epidermis und S. aureus konnten jedoch wachsen und bestätigten, dass sie grampositiv sind. Darüber hinaus gibt es einen deutlichen Unterschied zwischen den beiden Arten, weil der S. aureus in der Lage ist, Mannitol zu fermentieren, der den Methylrot-Indikator in den Medien aufgrund der sauren Nebenprodukte der Fermentation in ein helles Gelb verwandelt. Dies war im Fall von S. epidermisnicht zu sehen.

Das EMB-Medium hingegen ist selektiv für gramnegative Organismen, da die eosin- und methylenblauen Farbstoffe toxisch für grampositive Zellen sind. Die äußere Membran von gramnegativen Bakterien verhindert, dass diese toxischen Farbstoffe in die Zellen gelangen, was bedeutet, dass sie wachsen können. Darüber hinaus zeigt dieses Medium an, ob die vorhandenen Bakterienarten in der Lage sind, Lactose zu fermentieren. Hier färben sich E. coli-Kolonien in einer dunkelvioletten Farbe, manchmal mit einem grünen metallischen Glanz, der auf Gärung hinweist. P. vulgaris wächst auf diesem Medium, fermentiert aber keine Lactose und erscheint daher ein hellrosa bis violett es in Gegenwart des Farbstoffs. Im anaeroben Zustand sollten die Bakterienarten auf TSA-Medien noch wachsen, können dies aber im Vergleich zu solchen mit reichlich Sauerstoff sehr schlecht tun. Dies liegt daran, dass keine der Testarten anAerobes sind.

Experimente wie diese zur Bereicherung der Wachstumsumgebung können dazu beitragen, eine bestimmte Art von einer gemischten Probe zu begünstigen und zu isolieren. Sie können auch dazu beitragen, die optimalen Wachstumsbedingungen für verschiedene Bakterienarten in einem Labor zu bestimmen und so die weitere Forschung zu unterstützen.

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