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エンリッチメント培養:選択的および差動媒体における好気性微生物と嫌気性微生物の培養

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バクテリアは、砂漠のツンドラから熱帯雨林まで、地球上のほぼすべての環境に生息できます。非常に異なるニッチを植民地化するこの能力は、その適応性と広大な代謝多様性に起因し、エネルギー生成に多種多様な分子を利用することができます。地球上の細菌種の1%未満が栽培可能と考えられており、これらは特定の代謝および環境ニーズを理解した上でのみ可能であるという現象につながる多様性のこの大規模な配列です。

研究室でメディアや環境の操作を行うことで、研究者は、対象の種を培養するための最適な条件を見つけるために実験を行うだけでなく、エンリッチメントを可能にし、条件を変更するプロセスを選択することができます。混合培養物からの特定の種。いくつかの微生物種はジェネラリストであり、様々な状態や環境に耐えることができる。このような生物は、実験室の条件下で容易に成長する可能性がありますが、極端な生息地を与えられた場合、成長を妨げる可能性があります - この条件に耐性のある混合培養から生物を豊かにすることが目的であれば助けることができます。

断固たる生物は、特定の条件が満たされた場合にのみ、培養可能なことができます。例えば、ネイセリアまたはヘモフィラス種は、部分的に分解された赤血球および高い二酸化炭素濃度を含む培養物を必要とし、他の種の増殖を妨げる可能性もある。極端な好みは、非常に低いまたは高温、減少または酸素不在条件、または高塩の存在下で、極端な条件のための彼らの好みのために命名されています。これらの条件は、他のほとんどの微生物に耐えられない可能性があります。

関心のある生物のためにさらに豊かにするために、いくつかのメディアタイプは、生物の代謝に洞察力を与える指標が含まれています。マンチトール塩寒天は、高塩に敏感な生物の成長を阻害します。グラム陰性細菌は通常生き残ることはできませんが、グラム陽性黄色ブドウ球菌は繁栄することができます。さらに、MSA寒天は、発酵の酸副産物がメディア内のメチル赤色指標を明るい黄色に変えるため、マンニトールを発酵できるコロニーを示します。これにより、種のより具体的な選択が可能になります。

もう一つの一般的な濃縮培地であるエオシンメチレンブルーには、グラム陽性生物に有毒なエオシンとメチレンブルー染料が含まれています。また、これを発酵させることができるこれらのプレート上のラクトースや細菌が含まれており、pH奨励色素の吸収を低下させる酸を生成します。これらのコロニーは、顔料の大量を取り、暗く、金属的に見えます。このラボでは、3つの異なるメディア条件で4つの異なる試験生物を成長させ、その発達を観察する前に好気性対嫌気性条件下で成長させます。

実験を始まる前に、手をよく洗って乾かしてから、適切な大きさの実験室用手袋を着用してください。その後、5%漂白剤で作業面を殺菌し、徹底的に拭き取ります。次に、無菌接種ループを取り、それがベンチ表面に触れないように空の125ミリリットルフラスコに取り扱います。次に、冷蔵庫から、マンニトール塩寒天(MSA)の4枚のプレート、エオシンメチレンブルー寒天、EMB、および8トリプティック大豆寒天、またはTSAのプレートを収集します。TSA培地は、2つの異なる環境条件に使用される非選択的成長培地である。最後に、チューブラックに興味のあるあなたの文化を収集します。ここでは、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、プロテウス・ブルガリスが成長する。

まず、ツールを殺菌するために使用されるブンゼンバーナーを点灯します。次に、MSA プレート 1 つ、EMB プレート 1 つ、および TSA プレート 2 つを手元に置きます。次に、細菌培養物の1つを選択します。あなたは最初の培養でこれらのプレートの4つすべてを接種します。あなたの自由な手で、接種ループをピックアップし、それが数秒間オレンジ色に輝くまで、バーナーの炎でそれを殺菌します。ループが空気中で冷却できるようにします。その後、スープ培養管を開き、すぐに開口部を燃やす。培養にループを浸し、最初のプレートの最初の象限に生物をストリークします。その後、炎は再びループを殺菌し、第二象限をストリーク。炎の殺菌のこのアクションを繰り返し、その後、第3および第4象限を完了するためにストリーク。この方法でストリークは、孤立したコロニーを与え、また、文化が汚染されていないことを確認することを可能にする必要があります。

次に、蓋を交換し、プレートの底部に細菌、メディアの種類、日付、イニシャルの名前を付けます。次に、残りの3枚のプレートのそれぞれについて同じ細菌培養を用いてストリークメッキを繰り返し、毎回ラベルを付けます。最初の培養物が縞模様になったので、他の細菌が1つの接種MSAプレート、1つのEMBプレート、および各種の2つのTSAプレートを得るために、これらの手順を繰り返します。すべての生物が転送されたら、ループを最後の1回燃やします。

酸素の減少環境で成長できる生物を決定するには、密閉されたガス室システムを開き、4つのTSA細菌プレートの1セットを内部に置きます。その後、嫌気性状態の袋をチャンバーに入れ、しっかりと密封します。最後に、密閉されたガス室システム内を含むすべてのプレートを、一晩37°Cのインキュベーターに入れます。今後、24~48時間ごとにプレートをチェックして、コロニーが成長し、任意の指標反応物を代謝する時間を与えます。

異なる細菌種が各成長条件にどの程度反応したかを評価するために、まず、各培養タイプと嫌気性対好気性の状態でコロニーを生成することができた種の成長のためのプレートを調べます。成長する生物の色だけでなく、コロニーの大きさや形に注意してください。

マンニトール塩寒天培地は、6で生存することができるグラム陽性生物のために選択的である。5% 塩化ナトリウム.この実験では、高塩濃度のためにグラム陰性大腸菌及びP.バルガリスが成長しなかったことを意味する。しかし、S.表皮とS.アウレウスは、グラム陽性であることを確認して成長することができました。さらに、S.aureusは、発酵の酸副産物による明るい黄色にメディア内のメチル赤色指標を回すマンニトールを発酵することができるので、2つの種の間に明確な違いがあります。これはS.表皮の場合には見られなかった。

一方、EMB培地は、エオシンおよびメチレン青色染料がグラム陽性細胞に有毒であるため、グラム陰性生物に対して選択的である。グラム陰性菌の外膜は、これらの有毒な染料が細胞に入るのを防ぎ、成長できることを意味します。また、この培地は、存在する細菌種がラクトースを発酵させることができるかどうかを示す。ここで、大腸菌コロニーは濃い紫色に変わり、時には発酵を示す緑色の金属光沢を伴う。P.ブルガリスは、この媒体上で成長するが、ラクトースを発酵させていないので、染料の存在から紫色に明るいピンク色に表示されます。嫌気性の状態では、TSA培地上の細菌種はまだ成長する必要がありますが、十分な酸素を持つものに比べて非常に貧弱に行うことができます。これは、いずれの試験種もアエロベを義務付けているからである。

成長環境を豊かにするためにこのような実験は、混合サンプルから特定の種を有利にし、分離するのに役立ちます。また、実験室で異なる細菌種に最適な増殖条件を決定するのに役立ち、さらなる研究に役立ちます。

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