Overview
ソース: クリストファー・P・コルボ1, ジョナサン・F・ブレイズ1, エリザベス・スーター1
1ワーグナーカレッジ生物科学科、1キャンパスロード、スタテンアイランドニューヨーク、10301
原核細胞は、この惑星上のほぼすべての環境に生息することができる。王国として、彼らは大きな代謝多様性を持ち、エネルギー生成(1)のために多種多様な分子を使用することができます。したがって、研究室でこれらの生物を培養する際には、エネルギーを作るために必要なすべての分子と特定の分子を成長培養培養剤に提供する必要があります。代謝的に多様な生物もあれば、高温または低温、アルカリ性および酸性pH、還元または酸素欠乏環境、または高塩を含む環境(2,3,4)などの極端な環境で生き残ることができる生物もあります。「極端な好酸球」と呼ばれていますが、これらの生物はしばしば増殖するためにこれらの強烈な環境を必要とします。科学者がそのような生物を成長させようとするとき、メディア成分だけでなく、特定の環境条件は、関心のある生物を正常に栽培するために考慮する必要があります。
科学者たちは、これらの種が成長する必要がある特定の要件を理解しているので、研究室で培養可能な生物を成長させることができます。しかし、培養可能な生物は、地球上に生息すると推定される種の1%未満を占めている(5)。遺伝子シーケンシングで検出したが、研究室では増殖できない生物は、培養不能と考えられている(6)。現時点では、これらの生物の代謝と成長条件について十分に知られていない。
断固たる生物は前者の2人の間のどこかに横たわっている。これらの生物は培養可能であるが、特定の成長培養培養成分や特定の成長条件など、非常に特定の成長条件を必要とする。このような属の2つの例は、部分的に分解された赤血球(チョコレート寒天とも呼ばれる)、ならびに特定の成長因子および二酸化炭素が豊富な環境(7)を必要とするネイセリアsp.およびヘモフィラスsp.である。必要な特定の成分のすべてがなければ、これらの生物は全く成長しません。多くの場合、すべての要件を満たしていても、これらの生物は不十分に成長します。
好気性、または酸素を含む酸素でしか増殖できない真核細胞とは異なり、原核細胞は、いくつかの発酵経路を用いて嫌気的に増殖し、十分なエネルギーを生成することができる(8)。他の原核生物は、微好気性、または酸素環境の低下、あるいはカプノフィリック、または高い二酸化炭素環境を好む(9)。これらの生物は、大気を変えなければならないので、豊かにするのがより難しい。酸素化された環境に敏感な生物と頻繁に働く科学者は、通常、嫌気性チャンバーとインキュベーターで動作し、アルゴンなどの重い不活性ガスが酸素を置き換えるためにポンプで送り込まれる(10)。また、水を利用して水素や二酸化炭素を発生させる密閉ガスパケットシステムや、パラジウムのような触媒を使用して大気中の酸素をすべて除去するシステムもあります。これらの市販キットは、上記の大気条件(10)のいずれかを作成することができる。
潜在的な感染を決定するために病原体を培養するか、自然環境に存在する細菌の特定の種を同定しようとしているかどうか、1つの問題が存在する。1つの生息地に生息する細菌種は一つもない。バクテリアは、人間の皮膚から地球の海まで、あらゆる場所で多細胞共同体として生きています(11)。1種の細菌を単離しようとする際、科学者は、孤立した地域に生息する他の多数の生物を排除するために働かなければならない。このため、細菌に対する濃縮成長培分は、多くの場合、2つの機能を行う。1 つ目は、メディアを選択的にする方法です。選択的剤は、いくつかの種が成長するのを防ぎ、他の種を阻害せず、しばしば他の種の成長を促進する(12)。媒体成分の第2の機能は、差分剤として働くことであってもよい。このような薬剤は、単離された生物の特定の生化学的特徴の同定を可能にする。適切な成長条件と一緒にいくつかの異なる選択的および差分媒体を組み合わせることで、科学者および診断士は、特定の単離物から特定の細菌種の存在を識別することができる。
同定を支援する選択的および差分媒体の一例は、臨床的に有意な生物黄色ブドウ球菌の場合である。この生物は、典型的にはマンニトール塩寒天上で培養される。この媒体は、ブドウ球菌のようないくつかのグラム陽性を含む高塩環境に住むことができる生物だけを選択するだけでなく、塩に敏感な任意の生物を阻害します。マンニトール糖は、この媒体の差分成分である。臨床的に有意なブドウ球菌種の中で、マンニトールを発酵できるのはS.aureusのみである。この発酵反応は、媒体中の赤色の赤色指標が黄色に変わる副産物として酸を生成します。他のブドウ球菌種(表皮ブドウ球菌など)は成長することができるが、メディアを赤色のままにする。
このラボ演習では、適切な無菌技術と、スープからの成長培った培宿の適切な接種を示します。また、濃縮培養媒体上の一般的な汚染物質生物の成長、嫌気性細菌に対するガスパッケージ嫌気培養システムの使用、およびグラムの推定同定のための異なる選択的および差動媒体の使用を紹介します。陽性およびグラム陰性の細菌。
Procedure
1. 準備
- 始め前に手をよく洗い、適切な大きさの手袋を着用してください。
- 5%の次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤)で作業面を殺菌し、完全に乾燥させます。
- 作業中にベンチトップに触れないように、空の120 mLエルレンマイヤーフラスコに接種ループを配置します。
2. 成長メディアと文化
- 冷蔵庫からマンニトールソル寒天(MSA)、エオシンメチレンブルー寒天(EMB)、8種類の大豆寒天(TSA)の4枚を冷蔵庫から集めます(これらは市販で購入できます)。
- 洗浄された作業領域にプレートを置きます。
- 次のブロス培養物を収集する:大腸菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、およびプロテウス・ブルガリス。注意:これらは好気性生物であるので、チューブのキャップはわずかに緩んでいる必要があります。
- すべてのカルチャを、清掃された作業面の試験管ラックに置きます。
3. 文化の移転とインキュベーション
- 手の届くところですべての材料を持ってベンチに立つか、座ります。
- 無菌技術を使用して細菌をプレートに移すには、まずループをオレンジ色に光るまで炎上させ、次に空気中で冷却できるようにします。
- ループが冷却される間、大腸菌のスープ培養を取り、その後、あなたの小指を使用してキャップを開きます。
- チューブの開口部を素早く燃やします。これは汚染を防ぐ。
- ループをチューブに浸し、生物をEMBプレートの最初の象限に取り付けます。
- 最初のストリークが実行された後、ループを炎上し、最初のストリークを1回または2回だけ横切る2番目のストリークを実行します。これにより、単一のコロニーの分離が可能になり、汚染があるかどうかを判断できます。
- プレートの 4 つの象限がすべて縞模様になるまで、この手順を繰り返します。
- 次に、残りの 4 つの生物を同じストリーク メッキ方で転送し、最終製品が 1 つの MSA プレート、1 つの EMB プレート、および 2 つの別々の TSA プレートが生物ごとに 1 つずつあるようにします。
- すべての生物が転送されたら、ループを最後に1回燃やし、それを片付けます。
- 各生物を入れたTSAプレートをガスパケットに入れ、ガス袋を振ってからプレートと並んでチャンバーに入れます。しっかりとシールします。
- すべてのプレートを一晩37°Cでインキュベートします。
- 作業面を5%漂白剤で最後の1回殺菌します。
4. 結果の読み取りと記録
- インキュベーターからプレートを取り出し、クリーンなラボベンチに置きます
- ラボ ノートブックの各プレートの生物の成長に注意してください。特に、次の事項に関する詳細なメモを取ります。
- 各プレート上のコロニーの数とサイズ(存在する場合)、各めっきされた歪み
- MSAプレート上に成長するコロニーを取り巻く寒天の外観
- EMBプレート上で成長するコロニーの外観
- ガスパッケージ内と外側に成長したTSAプレート間の成長の違い
バクテリアは、砂漠のツンドラから熱帯雨林まで、地球上のほぼすべての環境に生息できます。非常に異なるニッチを植民地化するこの能力は、その適応性と広大な代謝多様性に起因し、エネルギー生成に多種多様な分子を利用することができます。地球上の細菌種の1%未満が栽培可能と考えられており、これらは特定の代謝および環境ニーズを理解した上でのみ可能であるという現象につながる多様性のこの大規模な配列です。
研究室でメディアや環境の操作を行うことで、研究者は、対象の種を培養するための最適な条件を見つけるために実験を行うだけでなく、エンリッチメントを可能にし、条件を変更するプロセスを選択することができます。混合培養物からの特定の種。いくつかの微生物種はジェネラリストであり、様々な状態や環境に耐えることができる。このような生物は、実験室の条件下で容易に成長する可能性がありますが、極端な生息地を与えられた場合、成長を妨げる可能性があります - この条件に耐性のある混合培養から生物を豊かにすることが目的であれば助けることができます。
断固たる生物は、特定の条件が満たされた場合にのみ、培養可能なことができます。例えば、ネイセリアまたはヘモフィラス種は、部分的に分解された赤血球および高い二酸化炭素濃度を含む培養物を必要とし、他の種の増殖を妨げる可能性もある。極端な好みは、非常に低いまたは高温、減少または酸素不在条件、または高塩の存在下で、極端な条件のための彼らの好みのために命名されています。これらの条件は、他のほとんどの微生物に耐えられない可能性があります。
関心のある生物のためにさらに豊かにするために、いくつかのメディアタイプは、生物の代謝に洞察力を与える指標が含まれています。マンチトール塩寒天は、高塩に敏感な生物の成長を阻害します。グラム陰性細菌は通常生き残ることはできませんが、グラム陽性黄色ブドウ球菌は繁栄することができます。さらに、MSA寒天は、発酵の酸副産物がメディア内のメチル赤色指標を明るい黄色に変えるため、マンニトールを発酵できるコロニーを示します。これにより、種のより具体的な選択が可能になります。
もう一つの一般的な濃縮培地であるエオシンメチレンブルーには、グラム陽性生物に有毒なエオシンとメチレンブルー染料が含まれています。また、これを発酵させることができるこれらのプレート上のラクトースや細菌が含まれており、pH奨励色素の吸収を低下させる酸を生成します。これらのコロニーは、顔料の大量を取り、暗く、金属的に見えます。このラボでは、3つの異なるメディア条件で4つの異なる試験生物を成長させ、その発達を観察する前に好気性対嫌気性条件下で成長させます。
実験を始まる前に、手をよく洗って乾かしてから、適切な大きさの実験室用手袋を着用してください。その後、5%漂白剤で作業面を殺菌し、徹底的に拭き取ります。次に、無菌接種ループを取り、それがベンチ表面に触れないように空の125ミリリットルフラスコに取り扱います。次に、冷蔵庫から、マンニトール塩寒天(MSA)の4枚のプレート、エオシンメチレンブルー寒天、EMB、および8トリプティック大豆寒天、またはTSAのプレートを収集します。TSA培地は、2つの異なる環境条件に使用される非選択的成長培地である。最後に、チューブラックに興味のあるあなたの文化を収集します。ここでは、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、プロテウス・ブルガリスが成長する。
まず、ツールを殺菌するために使用されるブンゼンバーナーを点灯します。次に、MSA プレート 1 つ、EMB プレート 1 つ、および TSA プレート 2 つを手元に置きます。次に、細菌培養物の1つを選択します。あなたは最初の培養でこれらのプレートの4つすべてを接種します。あなたの自由な手で、接種ループをピックアップし、それが数秒間オレンジ色に輝くまで、バーナーの炎でそれを殺菌します。ループが空気中で冷却できるようにします。その後、スープ培養管を開き、すぐに開口部を燃やす。培養にループを浸し、最初のプレートの最初の象限に生物をストリークします。その後、炎は再びループを殺菌し、第二象限をストリーク。炎の殺菌のこのアクションを繰り返し、その後、第3および第4象限を完了するためにストリーク。この方法でストリークは、孤立したコロニーを与え、また、文化が汚染されていないことを確認することを可能にする必要があります。
次に、蓋を交換し、プレートの底部に細菌、メディアの種類、日付、イニシャルの名前を付けます。次に、残りの3枚のプレートのそれぞれについて同じ細菌培養を用いてストリークメッキを繰り返し、毎回ラベルを付けます。最初の培養物が縞模様になったので、他の細菌が1つの接種MSAプレート、1つのEMBプレート、および各種の2つのTSAプレートを得るために、これらの手順を繰り返します。すべての生物が転送されたら、ループを最後の1回燃やします。
酸素の減少環境で成長できる生物を決定するには、密閉されたガス室システムを開き、4つのTSA細菌プレートの1セットを内部に置きます。その後、嫌気性状態の袋をチャンバーに入れ、しっかりと密封します。最後に、密閉されたガス室システム内を含むすべてのプレートを、一晩37°Cのインキュベーターに入れます。今後、24~48時間ごとにプレートをチェックして、コロニーが成長し、任意の指標反応物を代謝する時間を与えます。
異なる細菌種が各成長条件にどの程度反応したかを評価するために、まず、各培養タイプと嫌気性対好気性の状態でコロニーを生成することができた種の成長のためのプレートを調べます。成長する生物の色だけでなく、コロニーの大きさや形に注意してください。
マンニトール塩寒天培地は、6で生存することができるグラム陽性生物のために選択的である。5% 塩化ナトリウム.この実験では、高塩濃度のためにグラム陰性大腸菌及びP.バルガリスが成長しなかったことを意味する。しかし、S.表皮とS.アウレウスは、グラム陽性であることを確認して成長することができました。さらに、S.aureusは、発酵の酸副産物による明るい黄色にメディア内のメチル赤色指標を回すマンニトールを発酵することができるので、2つの種の間に明確な違いがあります。これはS.表皮の場合には見られなかった。
一方、EMB培地は、エオシンおよびメチレン青色染料がグラム陽性細胞に有毒であるため、グラム陰性生物に対して選択的である。グラム陰性菌の外膜は、これらの有毒な染料が細胞に入るのを防ぎ、成長できることを意味します。また、この培地は、存在する細菌種がラクトースを発酵させることができるかどうかを示す。ここで、大腸菌コロニーは濃い紫色に変わり、時には発酵を示す緑色の金属光沢を伴う。P.ブルガリスは、この媒体上で成長するが、ラクトースを発酵させていないので、染料の存在から紫色に明るいピンク色に表示されます。嫌気性の状態では、TSA培地上の細菌種はまだ成長する必要がありますが、十分な酸素を持つものに比べて非常に貧弱に行うことができます。これは、いずれの試験種もアエロベを義務付けているからである。
成長環境を豊かにするためにこのような実験は、混合サンプルから特定の種を有利にし、分離するのに役立ちます。また、実験室で異なる細菌種に最適な増殖条件を決定するのに役立ち、さらなる研究に役立ちます。
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Results
マンネトール塩寒天(MSA):この培地は、塩化ナトリウム6.5%で生き残ることができるグラム陽性生物に対して選択的である。グラム陰性生物エシェリヒア大腸菌とプロテウス・ブルガリスは、塩濃度が高いため、この媒体では成長できないはずです。S. 表皮ミディスとS. アウレウスは成長できるはずです。S.aureusはマンニトールを発酵することができるので、メディアは2つの間で差異です - 発酵副産物として酸の生産のために明るい黄色のメチル赤色指標を回します。S.表皮は、プレート上のピンク色を維持する必要があります。
注:コロニーが小さい場合、この媒体の成長は、最適な温度で合計48時間の追加インキュベーションを必要とする可能性があります - ここでは、37°C。
エオシンメチレンブルー寒天(EMB):この媒体はグラム陰性生物に対して選択的であり、エシェリヒア大腸菌およびプロテウス・ブルガリスプレートは成長を示す必要があります。エオシンとメチレン色素はグラム陽性細胞に有毒なので、ストレプトコッカス種はいずれも成長すべきではありません。グラム陰性細胞の外膜は、染料が細胞に入るのを防ぎます。この媒体は、生物がラクトースを発酵させる能力をテストすることを可能にするので、差異である。大腸菌は、メディアでラクトースの発酵のために明るい紫色(多くの場合、十分に長く栽培された場合は緑色の金属光沢を持つ)を回します。P.ブルガリスは、成長することはできるが、ラクトースを発酵させません(しかし、それは他の糖を発酵させることができる)。
トリプスティック大豆寒天(TSA):この媒体は非選択的なので、すべての研究種が成長する必要があります。しかし、好気性と嫌気性の条件を比較すると、ガスパッケージのプレートは、より少ない成長(およびより小さなコロニー)を表示する必要があります。これは、デモンストレーションで増殖した細菌のいずれもエアロベを義務付けないためであるが、その最適な成長条件には酸素が含まれるからである。
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Applications and Summary
異なる細菌種は、異なる環境で成長することができ、エネルギーを生成する方法として異なる炭素源を使用することができる。ラボで培養物としてこれらを使用する場合、成長培養中の成分を知り、成長培養剤を細菌種に合わせて行う必要があります。科学者や診断士はまた、異なる種を他の種から分離する方法として、また混合環境で細菌を識別し、同定する方法として、様々な生化学反応を利用することができます。
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