Reinkulturen und Streak-Plating: Isolierung einzelner Bakterienkolonien aus einer gemischten Probe

Auf einer Petrischale, wenn ein einzelnes Bakterium mehrere Runden der asexuellen Fortpflanzung durchläuft, wird es zur Bildung einer Klonkolonie führen. Es kann jedoch schwierig sein, ein einzelnes Bakterium aus einer gemischten Probe, wie z. B. einer Bodensuspension, zu erhalten. Wenn man eine Schleife dieser heterogenen Kultur nimmt, kann sie bis zu einer Billion einzelne Bakterien enthalten. Um diese vielen Bakterien auf die Oberfläche einer Agarplatte zu verteilen und eine einzige Kolonie zu erhalten, selbst mit einem Zick-Zack-Muster, müsste die Schleife kontinuierlich über die Oberfläche von genügend Platten gezogen werden, die nebeneinander gesetzt werden, um die gesamte Liberty Island einzukreisen. Offensichtlich verwenden Wissenschaftler nicht wirklich so viele Platten. Stattdessen verwenden sie eine Technik namens Streak Plating.

Die Streifenplattentechnik basiert auf der progressiven Verdünnung einer bakteriellen Probe und wird über die Volumenmedienoberfläche einer einzelnen Petrischale durchgeführt. Zunächst wird die Medienoberfläche visuell in fünf Abschnitte unterteilt, indem vier Fragmente des Umfangs als die ersten vier Abschnitte und die Mitte der Platte als der fünfte zugewiesen werden. Dadurch werden effektiv fünf Medienplatten aus einer einzigen Petrischale erstellt. Als nächstes wird der erste Abschnitt mit einem Zick-Zack-Muster mit einer Schleife des gewünschten Inokulums gestreift. Dann wird entweder eine neue Einwegschleife verwendet, oder im Falle einer Drahtschlaufe wird sie mit einem Bunsenbrenner sterilisiert, der sie bis zu ihrer roten Hitze entlang der Länge des Drahtes flammt. Diese Verwendung einer neuen Schleife, oder Flammsterilisation Schleife, entfernt alle verbleibenden Bakterienzellen, hilft bei der Verdünnung der Bakterien. Die Hot Loop wird dann für einige Sekunden in der Luft gekühlt, bevor sie durch den ersten Abschnitt gezogen wird, um drei bis vier separate Linien zu erstellen, die jeweils nur einen Bruchteil der Bakterien in den zweiten Abschnitt tragen. Die übrigen Abschnitte werden auf die gleiche Weise gestreift, wobei jedes Mal eine sterile Schleife und ein einzelner Durchgang durch den vorherigen Streifen verwendet wird.

Mit diesem Zyklus des Streichens und Sterilisierens sollte die bakterienkonzentration in jedem nachfolgenden Abschnitt verdünnt werden, so dass der letzte Abschnitt nur wenige diskret lokalisierte Bakterien enthält. Bei der Inkubation vermehren sich diese diskreten Bakterien, um isolierte Klonkolonien von Tochterzellen zu produzieren, die als Koloniebildnereinheiten oder KBE bezeichnet werden. Diese können geerntet und neu gestreift werden, um sicherzustellen, dass die nachfolgende Arbeit nur einen einzigen Bakterientyp umfasst, der als reine Kultur bezeichnet wird. Neben der Isolierung einzelner Kolonien aus einer gemischt-bakteriellen Kultur wird die Streifenbeschichtungstechnik auch verwendet, um medienspezifische Stämme auszuwählen, die bakterielle Koloniemorphologie zu bestimmen oder verschiedene Bakterienarten zu identifizieren. In diesem Video zeigen wir, wie man einzelne bakterielle Kolonien von einer gemischt-bakteriellen Probensuspension mittels Streifenbeschichtungstechnik isoliert.

Zunächst einmal Laborhandschuhe und einen Labormantel anziehen. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Als nächstes wählen Sie ein geeignetes Medium, das die genutzten Bakterienarten oder Stämme aufrechterhält, und beginnen Sie mit der Vorbereitung der Medien. Hier wird der gewöhnliche LB-Agar hergestellt, indem zehn Gramm vorformulierte, pulverisierte Medien und 7,5 Gramm Agar gewogen werden. Fügen Sie die gewogenen, getrockneten Komponenten in eine Glasflasche, die in der Lage ist, das Doppelte des endigen Volumens zu halten, um überlaufen zu vermeiden. Dann 500 Milliliter Wasser in die Flasche geben und halbfest verschließen. Sterilisieren Sie die Medien, indem Sie die Flasche in einem Autoklaven auf 121 Grad Celsius für zwanzig Minuten. Verwenden Sie nach Abschluss hitzebeständige Handschuhe oder ein Hotpad, um das Medium aus der Maschine zu entfernen, und drehen Sie dann sofort den Flaschenverschluss, um ihn fest zu schließen.

Lassen Sie die Medien für den gleichen Tag abkühlen, indem Sie die Flasche in ein auf ca. 45 Grad Celsius erhitztes Wasserbad legen, um die Medien in einem flüssigen Zustand zu erhalten. Alternativ können die Medien bei Raumtemperatur gelassen werden, um sie bei festem Zustand zu speichern. Bei Bedarf Mikrowelle die Flasche mit dem Deckel leicht geöffnet, um die Medien zu schmelzen, und lassen Sie die Medien mit einem 45 Grad Celsius Wasserbad abkühlen.

Als nächstes nehmen Sie eine Hülse mit sterilen Petri-Gerichten und mit einem permanenten Marker, kennzeichnen Sie sie mit dem Ermittler und Mediennamen sowie dem Datum. Übertragen Sie dann das benötigte Medienvolumen in ein steriles Gefäß und fügen Sie bei Bedarf Antibiotika oder andere empfindliche Komponenten hinzu. Hier werden 50 Milliliter Medien mit 100 Mikroliter Kanamycin für eine Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter gemischt. Wirbeln Sie das Rohr, um eine gleichmäßige Verteilung der hinzugefügten Komponenten über die Medien zu gewährleisten. Langsam, um Blasenbildung zu vermeiden, gießen Sie 20 bis 25 Milliliter von etwa 45 Grad Celsius Kulturmedium in jede der Platten. Wenn Blasen oder Schaum auftreten, schnell mit einer normalen Pipette und einer sterilen Spitze entfernen. Dann sofort alle Deckel austauschen, um eine Kontamination zu verhindern. Lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur für mindestens zwei Stunden oder über Nacht erstarren. Nach der Erstarrung die Kulturplatten bei vier Grad Celsius auf den Kopf stellen, um die Kondensation auf der Oberfläche des Mediums zu minimieren.

Um die Kultur der Wahl zu streifen, nehmen Sie zuerst eine saubere Kulturplatte und entfernen Sie den Deckel. Schnell arbeiten, eine Einweg-, sterile Schleife in das gewünschte Inokulum tauchen und dann sofort die Schleife mit einer Zick-Zack-Bewegung über den ersten Quadranten der Platte wischen. Ersetzen Sie den Deckel der Schale, entsorgen Sie die verwendete Impfschleife, und wählen Sie dann eine neue sterile Schleife aus. Mit der neuen Schleife, machen drei bis vier Striche, die die ursprüngliche Tupferlinie aus dem ersten Quadranten, die eine relativ dichte Bakterienpopulation in den zweiten Quadranten enthalten sollte. Schließen Sie den Deckel noch einmal, und entsorgen Sie die Schleife. Mit einer neuen Schleife wiederholen Sie diese Aktion erneut, aber dieses Mal streifen von der zweiten in den dritten Quadranten. Dann, mit einer neuen Schleife wieder, machen sie einen weiteren Streifen vom dritten in den vierten Teil der Platte. Schließlich, mit einer frischen Schleife, machen Sie einen letzten Schlag in einem Zick-Zack-Muster vom vierten Quadranten in Richtung der Mitte der Platte. Die bakterielle Prävalenz wird in diesem Bereich geringer sein, idealerweise können einzelne Kolonien aus einer einzigen lebensfähigen Mutterzelle gebildet werden.

Ersetzen Sie den Plattendeckel, und, falls für die Bakterienarten geeignet, versiegeln Sie die Platte mit Parafolie, um Luftstrom zu verhindern. Drehen Sie die Kulturplatte auf den Kopf, um Kondensationstropfen zu verhindern, und platzieren Sie sie dann bei einer geeigneten Temperatur für das Wachstum. Hier wird ein Inkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt. Lassen Sie die Platte brüten, bis Bakterienkolonien sichtbar sind. Um eine klonale Bakterienpopulation zu erzeugen, wählen Sie eine diskrete Kolonie aus dieser Platte aus. Berühren Sie nun mit der sterilen Schleife die Zielkolonie und machen Sie wie bisher einen Streifen im ersten Quadranten einer neuen Platte. Weiterhin die Schleife abwechselnd sterilisieren und die verbleibenden Quadranten der Platte, wie zuvor gezeigt, streifen, endend mit dem Zick-Zack zur Mitte. Schließen Sie die Platte, und legen Sie sie zu brüten, bis sich diskrete Kolonien bilden. Sobald diese Kolonien angebaut sind, stellen sie in der Regel reine klonale Stämme dar.

Die anfängliche Streifenplatte kann Kolonien enthalten, die aus Zellen verschiedener Bakterienarten oder Zellen mit unterschiedlicher genetischer Zusammensetzung stammen, abhängig von der Probenreinheit. Durch die nachfolgende Isolierung einer einzelnen Kolonie, bei der alle Einheiten aus einer gemeinsamen Mutterzelle abgeleitet sind, erzeugt das zweite Streifenverfahren eine relativ klonale Bakterienpopulation, die für eine weitere Charakterisierung oder Impfung in Brühe geeignet ist.