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純粋な培養物と縞めっき:混合サンプルからの単一細菌コロニーの単一の分離

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ペトリ皿では、単一の細菌が無性生殖の複数のラウンドを受ける場合、それはクローンコロニーの形成につながります。しかしながら、土壌懸濁液などの混合試料から単一の細菌を得ることは困難であり得る。この異種培養物のループを1つ取れば、1兆個もの個々の細菌を含むことができる。この多くの細菌を寒天プレートの表面に広げ、単一のコロニーを得るためには、ジグザグパターンを使用しても、ループはリバティ島全体を囲むために並んで設定された十分なプレートの表面上に連続的にドラッグする必要があります。明らかに、科学者は実際にそれほど多くのプレートを使用していません。代わりに、彼らはストリークメッキと呼ばれる技術を使用しています。

ストリークプレート技術は、細菌サンプルの進行性希釈に基づいており、単一のペトリ皿の固体媒体表面上で行われます。まず、メディアサーフェスは、円周の 4 つの断片を最初の 4 つのセクションとして割り当て、プレートの中心を 5 番目のセクションとして割り当てることによって、5 つのセクションに視覚的に分割されます。これにより、1 つのペトリ皿から 5 つのメディア プレートが効果的に作成されます。次に、所望の接種のループフルを使用して、最初のセクションはジグザグパターンを使用して縞状になる。その後、新しい使い捨てループが使用されるか、またはワイヤループの場合には、ブンセンバーナーで殺菌され、ワイヤーの長さに沿って赤くなるまで燃やします。この新しいループ、または炎殺菌ループの使用は、細菌の希釈を助ける残りの細菌細胞を除去する。ホットループは、最初のセクションを通ってドラッグされる前に数秒間空気中で冷却され、それぞれが2番目のセクションに細菌のほんの一部を運ぶ3〜4つの別々のラインを作成します。残りのセクションは、毎回無菌ループを使用して、同じ方法でストリークされ、前のストリークを1回通過します。

ストリークと殺菌のこのサイクルを使用して、すべての後続のセクションの細菌濃度を希釈し、最後のセクションが少数の個別に位置する細菌のみを含むようにする必要があります。インキュベーション時に、これらの離散細菌は、コロニー形成単位、またはCCFと呼ばれる娘細胞の単離されたクローンコロニーを生成するために増殖する。これらは、純粋な培養と呼ばれる単一の細菌タイプのみを含むことを保証するために、収穫し、再ストリークすることができます。混合細菌培養から単一のコロニーを単一のコロニーを分離するだけでなく、ストリークめっき技術は、培養特異的株を選択したり、細菌コロニー形態を決定したり、異なる細菌種を同定するためにも使用されます。このビデオでは、ストリークメッキ技術を介して混合細菌サンプル懸濁液から単一細菌コロニーを分離する方法を示します。

まず、ラボグローブとラボコートを着用してください。次に、70%エタノールを使用してワークスペースを殺菌します。次に、利用される細菌種または菌株を維持し、培地の準備を開始する適切な培地を選択する。ここでは、一般的なLB寒天は、予め処方された粉末媒体と7.5グラムの寒天の10グラムを計量することによって調製される。オーバーフローを避けるために、最終容積の2倍を保持することができるガラスボトルに計量された乾燥したコンポーネントを追加します。その後、ボトルに500ミリリットルの水を追加し、半しっかりとキャップします。ボトルを121°Cに設定したオートクレーブに20分間置いてメディアを殺菌します。完成後、耐熱手袋またはホットパッドを使用して機械からメディアを取り外し、ボトルキャップを直ちにねじってしっかりと閉じます。

同日中に使用する場合は、ボトルを約45°Cに加熱した水浴に入れ、メディアを液体状態に保ち、冷やします。あるいは、培地を室温のままにしておき、固体状態で保存することができる。必要に応じて、蓋をしてボトルを電子レンジで加熱してメディアを溶かし、45°Cの水浴を使用してメディアを冷却します。

次に、無菌ペトリ皿のスリーブを取り、永久的なマーカーで、調査官とメディア名だけでなく、日付でそれらをラベル付けします。次に、必要な量の培温を滅菌容器に移し、必要に応じて抗生物質またはその他の敏感成分を添加する。ここで、50ミリリットルの培媒体を100マイクロリットルのカナマイシンと混合し、1ミリリットル当たり25マイクログラムの最終濃度を有する。チューブを旋回して、メディア全体に追加されたコンポーネントの均等な分布を確保します。ゆっくりと、気泡形成を避けるために、各プレートに約45°Cの培養培地の20~25ミリリットルを注ぐ。泡や泡が現れた場合は、通常のピペットと無菌チップを使用して速やかに取り外します。その後、直ちにすべての蓋を交換して汚染を防ぎます。寒天を室温で少なくとも2時間または一晩固変させる。固着したら、培養プレートを4°Cで逆さまに保存し、媒体の表面の結露を最小限に抑えます。

選択した培養をストリークするには、まずきれいな培養プレートを取り、蓋を取り除きます。迅速に作業し、使い捨て可能な無菌ループを目的の接種に沈め、ジグザグ運動を使用してプレートの最初の象限上でループを直ちに綿棒に振ります。皿のふたを交換し、使用した接種ループを廃棄し、新しい無菌ループを選択します。新しいループを使用して、最初の象限から放射される元の綿棒線を横切る 3 ~ 4 ストロークを作成します。蓋をもう一度閉じ、ループを破棄します。新しいループを使用して、この操作をもう一度繰り返しますが、今回は 2 番目から 3 番目の象限に連動します。その後、再び新しいループで、プレートの第3セクションから4番目のセクションに別のストリークを行います。最後に、新鮮なループで、プレートの中心に向かって4番目の象限からジグザグパターンで最後のストロークを作ります。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。

プレート蓋を交換し、細菌種に適宜、空気の流れを防ぐためにパラフィルムでプレートを密封します。凝縮の滴りを防ぐために培養プレートを逆さまにし、成長に適した温度に置きます。ここでは、インキュベーターは摂氏37度に設定されています。細菌のコロニーが見えるまでプレートをインキュベートできるようにします。クローン細菌集団を生成するには、このプレートから1つの離散コロニーを選択します。さて、無菌ループで、ターゲットコロニーに触れ、前と同様に、新しいプレートの最初の象限でストリークを作ります。ループを交互に殺菌し、前に示したようにプレートの残りの象限をストリークし続け、中央にジグザグで終わる。プレートを閉じ、離散コロニーが形成されるまでインキュベートするためにそれを配置します。これらのコロニーが成長すると、彼らは通常、純粋なクローン株を表します。

最初のストリークプレートは、サンプルの純度に応じて、異なる細菌種または異なる遺伝的構成を持つ細胞から生じるコロニーを含んでいてもよい。すべてのユニットが共通の母細胞から派生する単一コロニーのその後の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一によって、第二のストリークプロシージャは、ブロスへのさらなる特徴付けまたは接種に適した比較的クローン細菌集団を生成する。

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