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16S rRNAシーケンシング:細菌種を同定するPCRベースの技術

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地球には何百万もの細菌種が生息しており、それぞれがユニークな特徴を持っています。これらの種を同定することは、環境サンプルを評価する上で重要です。医師はまた、感染した患者を診断するために異なる細菌種を区別する必要があります。

細菌を同定するために、コロニーの形態を観察するために、特定の媒体上の形態の顕微鏡観察や成長を含む様々な技術を採用することができます。遺伝子解析は、細菌を同定するための別の技術が近年人気が高まっており、一部は16SリボソームRNA遺伝子シーケンシングに起因する。

細菌リボソームは、2つのサブユニットからなるタンパク質RNA複合体である。これら2つのサブユニットのうち小さい30Sサブユニットには、ゲノムDNAに含まれる16S rRNA遺伝子によってコードされる16S rRNAが含まれています。16S rRNAの特定の領域は、リボソームアセンブリに不可欠な機能のために、高度に保存されています。他の領域は、機能に対してそれほど重要ではないが、細菌種によって異なる場合がある。16S rRNAの可変領域は、細菌種に対するユニークな分子指紋として機能することができ、表現価が一般的に同一の株を区別することができます。

gDNAの品質サンプルを得た後、16S rRNAコード遺伝子のPCRを開始することができる。PCRは、二本鎖DNAテンプレートの変性のサイクル、遺伝子の保存状態の高い領域を増幅するユニバーサルプライマーペアのアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるプライマーの拡張からなる、一般的に使用される分子生物学法です。プライマーの中には、16S rRNAコード遺伝子のほとんどを増幅するプライマーもあれば、その断片のみを増幅するものもあります。PCR後、製品はアガロースゲル電気泳動を介して分析することができる。増幅が成功した場合、ゲルは、使用されるプライマーペアに応じて、16S rRNA遺伝子のおおよその長さである、期待されるサイズの単一バンドを含む必要があります。

精製およびシーケンシングの後、得られた配列をBLASTデータベースに入力し、参照16S rRNA配列と比較することができます。このデータベースは、最も高い類似性に基づいて一致を返すので、これは目的の細菌の同一性を確認することができます。このビデオでは、PCR、DNA配列解析および編集、配列アセンブリ、データベース検索を含む16S rRNA遺伝子シーケンシングを観察します。

微生物を取り扱う場合、無菌技術の使用や適切な個人用保護具の着用など、良好な微生物生物学的実践に従うことが不可欠です。対象の微生物または環境試料に対して適切なリスク評価を行った後、試験培養を得る。この例では、バチルス・サビリスの純粋な培養が用いられる。

まず、適切な条件で適切な培地で微生物を増育します。この例では、バチルス・サチリス168は、37°Cで200rpmに設定された揺動インキュベーターで一晩LBブロスで成長する。次に、市販のキットを使用して、B.サチリス一晩培養の1.5ミリリットルからゲノムDNAまたはgDNAを分離します。

単離されたDNAの品質を確認するには、まず、単離されたgDNAの5マイクロリットルを1マイクロリットルのDNAゲルロード色素と混合します。次に、サンプルを0.8%のアガロースゲルにロードし、SYBRセーフまたはEtBrなどのDNA染色試薬を含む。この後、ゲルに1キロベースの分子質量標準をロードし、前色素がゲルの底から約0.5センチメートルになるまで電気泳動を実行します。ゲル電気泳動が完了したら、青色光トランジユリニエータ上のゲルを視覚化します。gDNAは、サイズが10キロベースを超える厚いバンドとして表示され、塗りつぶしが最小限に抑えられます。

この後、gDNAのシリアル希釈を作成するために、3つのマイクロ遠心分離管に10X、100X、および1000Xとしてラベルを付けます。次に、ピペットを使用して、90マイクロリットルの無菌蒸留水を各チューブに分配します。次に、10XチューブにgDNA溶液の10マイクロリットルを追加します。溶液が完全に混合されていることを確認するために、ボリューム全体を上下にピペット。次に、10Xチューブから溶液の10マイクロリットルを取り出し、これを100Xチューブに移します。前述のように溶液を混ぜます。最後に、100Xチューブ内の溶液の10マイクロリットルを、1000Xチューブに移す。

PCRプロトコルを開始するには、氷上で必要な試薬を解凍します。次に、PCRマスターミックスを準備します。DNAポリメラーゼは室温で活性であるため、氷上で起こる反応が必要です。各PCRチューブにマスターミックスのアリコット49マイクロリットル。次に、各実験管に1マイクロリットルのテンプレートを加え、1マイクロリットルの滅菌水を負の制御管に加え、上下に配管して混合する。この後、表に記載されているプログラムに従ってPCRマシンを設定する。チューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを開始します。

プログラムが完了したら、前に示したように、アガロースゲル電気泳動を介して製品の品質を調べます。記載されたプロトコルを使用して成功した反応は、約1.5キロベースの単一バンドを生成する必要があります。この例では、100X希釈gDNAを含むサンプルは、最高品質の製品を得た。次に、市販のキットで、最高のPCR製品(この場合は100X gDNA)を精製します。これで、PCR 製品をシーケンス用に送信できるようになりました。

この例では、PCR 製品はフォワードプライマーとリバース プライマーを使用してシーケンスされます。したがって、DNA配列とDNAクロマトグラムを含む2つのデータセットが生成されます。まず、各プライマーから生成されたクロマトグラムを調べます。理想的なクロマトグラムは、バックグラウンド信号をほとんどまたは全く持たない均等なピークを持つ必要があります。

クロマトグラムが二重ピークを示す場合、PCR製品に複数のDNAテンプレートが存在している可能性があり、配列を破棄する必要があります。クロマトグラムに同じ場所に異なる色のピークが含まれている場合、シーケンシングソフトウェアはヌクレオチドと誤呼び出された可能性があります。このエラーは、テキスト ファイルで手動で識別および修正できます。クロマトグラムの広範なピークの存在は、関連する領域におけるヌクレオチドの誤カウントを引き起こす分解能の喪失を示す。このエラーは修正が困難であり、後続の手順のいずれかで不一致は信頼できないものとして扱う必要があります。クロマトグラム読み取り品質が悪く、複数のピークの存在によって示され、通常、配列の5つの素数および3つの素数端で生じる。一部のシーケンシング プログラムでは、これらの低品質のセクションが自動的に削除されます。シーケンスが自動的に切り捨てられなかった場合は、低品質のフラグメントを識別し、テキスト ファイルからそれぞれのベースを削除します。

DNA アセンブリ プログラムを使用して、2 つのプライマー 配列を 1 つの連続配列に組み立てます。フォワードプライマーとリバースプライマーを使用して取得したシーケンスは、部分的に重複する必要があります。DNA 組立プログラムで、FASTA 形式の 2 つのシーケンスを適切なボックスに挿入します。次に、送信ボタンをクリックし、プログラムが結果を返すのを待ちます。

組み立てられたシーケンスを表示するには、[結果] タブで [Contigs] をクリックします。次に、線形の詳細を表示するには、アセンブリの詳細を選択します。基本的なローカルアライメント検索ツール(BLAST)のウェブサイトに移動し、ヌクレオチドBLASTツールを選択してシーケンスをデータベースと比較します。クエリ シーケンステキスト ボックスにシーケンスを入力し、下のスクロール メニューで適切なデータベースを選択します。最後に、ページの下部にある BLAST ボタンをクリックし、ツールがデータベースから最も類似したシーケンスを返すのを待ちます。

この例では、トップヒットはB.subtilis株168であり、BLASTデータベース内のシーケンスとの100%のアイデンティティを示す。トップヒットが期待される種やひずみに100%のアイデンティティを示さない場合は、クエリに最も近いシーケンスをクリックして、線形の詳細を確認します。整列されたヌクレオチドは短い垂直線で結合され、不一致のヌクレオチドはそれらの間にギャップを持つことになります。識別された不一致の領域に焦点を当てて、シーケンスを修正し、必要に応じて BLAST 検索を繰り返します。

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