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Secuenciación 16S rRNA: Una técnica basada en PCR para identificar especies bacterianas

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La Tierra es el hogar de millones de especies bacterianas, cada una con características únicas. La identificación de estas especies es fundamental en la evaluación de muestras ambientales. Los médicos también necesitan distinguir diferentes especies bacterianas para diagnosticar pacientes infectados.

Para identificar bacterias, se pueden emplear una variedad de técnicas, incluyendo la observación microscópica de morfología o crecimiento en un medio específico para observar la morfología de la colonia. El análisis genético, otra técnica para identificar bacterias ha crecido en popularidad en los últimos años, debido en parte a la secuenciación del gen del ARN ribosomal 16S.

El ribosoma bacteriano es un complejo de ARN proteico que consta de dos subunidades. La subunidad 30S, la más pequeña de estas dos subunidades, contiene 16S rRNA, que está codificado por el gen rRNA 16S contenido en el ADN genómico. Las regiones específicas de 16S rRNA están altamente conservadas, debido a su función esencial en el montaje ribosoma. Mientras que otras regiones, menos críticas para funcionar, pueden variar entre las especies bacterianas. Las regiones variables en 16S rRNA, pueden servir como huellas moleculares únicas para las especies bacterianas, lo que nos permite distinguir cepas fenotípicamente idénticas.

Después de obtener una muestra de calidad de gDNA, pcR del gen de codificación 16S rRNA puede comenzar. La PCR es un método de biología molecular comúnmente utilizado, que consiste en ciclos de desnaturalización de la plantilla de ADN de doble cadena, recocido de pares de imprimación universales, que amplifican regiones altamente conservadas del gen, y la extensión de imprimaciones por ADN polimerasa. Mientras que algunos imprimadores amplifican la mayor parte del gen de codificación 16S rRNA, otros sólo amplifican fragmentos de él. Después de pcR, los productos se pueden analizar a través de electroforesis de gel de agarosa. Si la amplificación fue exitosa, el gel debe contener una sola banda de un tamaño esperado, dependiendo del par de imprimación utilizado, hasta 1500bp, la longitud aproximada del gen rRNA 16S.

Después de la purificación y la secuenciación, las secuencias obtenidas se pueden introducir en la base de datos BLAST, donde se pueden comparar con las secuencias rRNA de referencia 16S. Como esta base de datos devuelve coincidencias basadas en la mayor similitud, esto permite la confirmación de la identidad de las bacterias de interés. En este vídeo, observará la secuenciación del gen rRNA 16S, incluyendo PCR, análisis y edición de secuencia de ADN, montaje de secuencia según la base de datos.

Al manipular microorganismos, es esencial seguir buenas prácticas microbiológicas, incluyendo el uso de una técnica aséptica y el uso de equipos de protección personal adecuados. Después de realizar una evaluación de riesgos adecuada para el microorganismo o la muestra de interés ambiental, obtenga un cultivo de prueba. En este ejemplo, se utiliza una cultura pura de Bacillus subtilis.

Para empezar, haz crecer tu microorganismo en un medio adecuado en las condiciones adecuadas. En este ejemplo, Bacillus subtilis 168 se cultiva en caldo LB durante la noche en una incubadora de agitación establecida a 200 rpm a 37 grados centígrados. A continuación, utilice un kit disponible comercialmente para aislar el ADN genómico o el ADN electrónico de 1,5 mililitros del cultivo nocturno de B. subtilis.

Para comprobar la calidad del ADN aislado, primero mezcle cinco microlitros del ADN gDNA aislado con un microlitro de color ante la carga de gel de ADN. A continuación, cargue la muestra en un gel de agarosa del 0,8%, que contenga un reactivo de tinción de ADN, como SYBR seguro o EtBr. Después de esto, cargue un estándar de masa molecular de una kilobase en el gel, y ejecute la electroforesis hasta que el tinte frontal esté aproximadamente a 0,5 centímetros de la parte inferior del gel. Una vez que la electroforesis de gel esté completa, visualice el gel en un transiluminador de luz azul. El ADNes debe aparecer como una banda gruesa, por encima de 10 kilobase de tamaño y tener un mínimo de manchas.

Después de esto, para crear diluciones en serie del ADN, etiquete tres tubos de microcentrífuga como 10X, 100X y 1000X. A continuación, utilice una pipeta para dispensar 90 microlitros de agua destilada estéril en cada uno de los tubos. A continuación, agregue 10 microlitros de la solución de ADN-a g al tubo 10X. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la solución se mezcla a fondo. A continuación, retire 10 microlitros de la solución del tubo 10X y transfiera esto al tubo 100X. Mezcle la solución como se describió anteriormente. Finalmente, transfiera 10 microlitros de la solución en el tubo 100X, al tubo 1000X.

Para comenzar el protocolo PCR, descongelar los reactivos necesarios en el hielo. A continuación, prepare la mezcla maestra de PCR. Dado que la polimerasa de ADN está activa a temperatura ambiente, la reacción establecida debe producirse en el hielo. Aliquot 49 microlitros de la mezcla maestra en cada uno de los tubos PCR. Luego, agregue un microlitro de plantilla a cada uno de los tubos experimentales y un microlitro de agua estéril al tubo de control negativo, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Después de esto, configure la máquina PCR de acuerdo con el programa descrito en la tabla. Coloque los tubos en el termociclador e inicie el programa.

Una vez completado el programa, examine la calidad de su producto a través de la electroforesis de gel de agarosa, como se ha demostrado anteriormente. Una reacción exitosa utilizando el protocolo descrito debe producir una sola banda de aproximadamente 1,5 kilobase. En este ejemplo, la muestra que contiene 100X de ADN adobloca diluido produjo un producto de la más alta calidad. A continuación, purificar el mejor producto PCR, en este caso, el 100X gDNA, con un kit disponible comercialmente. Ahora el producto PCR se puede enviar para la secuenciación.

En este ejemplo, el producto PCR se secuencia mediante imprimaciones directas e inversas. Así, se generan dos conjuntos de datos, cada uno con una secuencia de ADN y un cromatograma de ADN: uno para la imprimación delantera y el otro para la imprimación inversa. En primer lugar, examine los cromatogramas generados a partir de cada imprimación. Un cromatograma ideal debe tener picos espaciados uniformemente con pocas o ninguna señal de fondo.

Si los cromatogramas muestran picos dobles, es posible que haya varias plantillas de ADN presentes en los productos PCR y la secuencia debe descartarse. Si los cromatogramas contenían picos de diferentes colores en la misma ubicación, es probable que el software de secuenciación haya llamado mal los nucleótidos. Este error se puede identificar y corregir manualmente en el archivo de texto. La presencia de picos amplios en el cromatograma indica una pérdida de resolución, lo que provoca recuentos erróneos de los nucleótidos en las regiones asociadas. Este error es difícil de corregir y las discrepancias en cualquiera de los pasos subsiguientes deben tratarse como poco fiables. La mala calidad de lectura del cromatograma, indicada por la presencia de múltiples picos, generalmente ocurre en los cinco extremos primos y tres extremos principales de la secuencia. Algunos programas de secuenciación eliminan estas secciones de baja calidad automáticamente. Si la secuencia no se truncó automáticamente, identifique los fragmentos de baja calidad y elimine sus respectivas bases del archivo de texto.

Utilice un programa de ensamblaje de ADN para ensamblar las dos secuencias de imprimación en una secuencia continua. Recuerde, las secuencias obtenidas utilizando imprimaciones hacia adelante e inversas deben superponerse parcialmente. En el programa de ensamblaje de ADN, inserte las dos secuencias en formato FASTA en el cuadro correspondiente. A continuación, haga clic en el botón Enviar y espere a que el programa devuelva los resultados.

Para ver la secuencia ensamblada, haga clic en Contigs en la pestaña de resultados. A continuación, para ver los detalles de la alineación, seleccione detalles de ensamblaje. Navegue hasta el sitio web para obtener la herramienta básica de búsqueda de alineación local, o BLAST, y seleccione la herramienta blast de nucleótidos para comparar la secuencia con la base de datos. Escriba la secuencia en el cuadro de texto de la secuencia de consulta y seleccione la base de datos adecuada en el menú desplegable. Por último, haga clic en el botón BLAST en la parte inferior de la página y espere a que la herramienta devuelva las secuencias más similares de la base de datos.

En este ejemplo, el hit más alto es B. subtilis strain 168, mostrando 100% de identidad con la secuencia en la base de datos BLAST. Si el hit superior no muestra 100% de identidad a su especie o cepa esperada, haga clic en la secuencia que coincida más estrechamente con su consulta para ver los detalles de la alineación. Los nucleótidos alineados se unirán por líneas verticales cortas y los nucleótidos no coincidentes tendrán huecos entre ellos. Centrándose en las regiones no coincidentes identificadas, revise la secuencia y repita la búsqueda BLAST si lo desea.

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