Overview
资料来源：安德鲁·范阿尔斯特1，瑞安农M.勒维克1，纳塔利娅·马丁1，维克多·迪丽塔1
1密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系，美国密歇根州东兰辛分校
生长曲线提供了有关细菌生长动力学和细胞生理学的宝贵信息。它们使我们能够确定细菌在可变生长条件下的反应，并为给定细菌定义最佳生长参数。原型增长曲线通过四个增长阶段前进：滞后、指数、静止和死亡 （1）。
图1：细菌生长曲线。在批量培养中生长的细菌通过四个生长阶段：滞后、指数、静止和死亡。滞后期是细菌达到能够快速细胞生长和分裂的生理状态的时间段。指数阶段是细胞生长和分裂速度最快的阶段，在此期间，DNA复制、RNA转录和蛋白质生产均以恒定、快速的速度发生。固定阶段的特点是由于营养限制和/或有毒中间积累，细菌生长减慢和停滞。死亡期是细胞溶血由于严重营养限制而发生的阶段。
滞后期是细菌达到能够快速细胞生长和分裂的生理状态的时间段。出现这种滞后的原因是细菌需要时间来适应新的环境。一旦必要的细胞成分在滞后阶段产生，细菌进入指数增长阶段，DNA复制、RNA转录和蛋白质生产都发生
Procedure
1. 设置
- 所需的实验室材料：液体介质、凝固琼脂介质、Erlenmeyer烧瓶、15 mL试管、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、细菌细胞扩散器、70%乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前都必须消毒。
- 使用 70% 乙醇进行消毒，为工作站做好准备。在 Bunsen 燃烧器附近工作，以防止介质污染。
- 使用细菌时，应使用适当的个人防护设备和无菌技术。使用细菌培养物时，需要实验室外套和手套。
- 缓冲剂、溶液和试剂的配方
- 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （8）。
- 卢里亚-贝尔塔尼兄弟 （LB） （9）。
2. 议定书
- 媒体准备
- 识别生长介质，用于培养细菌，并在单独的可高压灭菌瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v琼脂）培养基。在这里，LB肉汤和LB琼脂为大肠杆菌的生长做好了准备。
- 在设置为 121°C 的高压灭菌器中，用半紧固盖对介质进行消毒 35 分钟。
- 对于琼脂介质，在高压灭菌后，放入设置为 50°C 的水浴中 30 分钟冷却。冷却后，将 20-25 mL 琼脂胶培养基倒入 100x15mm 圆形培养皿中。在使用前，让板在室温下设置24小时。
- 细菌的初始制备
- 从冷冻库存中，条纹细菌在选定的介质琼脂上分离，以获得单菌群分离物。在允许为所选细菌生长条件下孵育。在这里，大肠杆菌在LB琼脂上条纹，在37°C过夜（16-18小时）孵育。
- 使用无菌接种回路，从条纹板中选择单个菌落，在15 mL试管中接种4 mL液体介质，并在所选细菌允许的条件下生长。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，在210rpm的转速下摇动过夜（16-18小时）。
- 增长曲线设置
- 生长瓶制备
- 高压灭菌器适当大小埃伦迈耶烧瓶。通常使用 1：5 的介质与总烧瓶体积的比率。在这里，100 mL LB 介质用于 500 mL 烧瓶。
- 使用血清学移液器，将无菌介质转移到 Erlenmeyer 烧瓶。
- 稀释系列制备
- 标签 15 mL 试管： -1， -2， -3， -4， -5， -6， -7， -8 和 -9， 将 9mL PBS 分布到每个。这些数字对应于用于计算 CFU/mL 的稀释系数。每个收集时间点都需要一组新的管。（图2）
- 阿加板制备
- 带有收集时间和稀释系数的标签板。对于每个时间点，每个稀释都有一个板。
- 生长瓶制备
- 增长曲线协议
- 媒体接种
- 使用步骤 2.2.2 中准备的隔夜液体培养液，用 1：1000 容量的培养液为烧瓶介质接种。在这里，100 μL 隔夜液体培养剂添加到 100 mL LB 介质中。
- 旋转介质以均匀分布细菌。
- 时点集合
- 生长条件设置
- 在为给定细菌选择的实验生长条件下放置烧瓶。对于快速生长的细菌，应经常使用时间点，对于生长缓慢的细菌，可以以较长的间隔进行。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，以每分钟210转（rpm）摇动，每1小时采集一次时间点。
- 光学密度 （OD600） 测量
- 在每个时间点，包括起始时间点（t = 0），提取1 mL的细菌培养物，并分配到分光光度计比色皿中。
- 擦拭比色皿，并将光密度记录在 600 nm 波长。如果光学密度读数大于 1.0，则使用 900 μL 新介质稀释 100 μL 培养物 1：10，记录光学密度，并将此值乘以 10 进行 OD600 测量。
- 殖民地形成单元 （CFU/mL） 测量
- 在每个时间点，提取1 mL的细菌培养物，并放入含有9 mL PBS的-1玻璃试管中。
- 对于稀释系列，从 -1 管将 1 mL 从 -1 管向下所有稀释管转移到 -9，每次传输后涡旋。（图2）
- 对于每次稀释，将100 μL的细胞悬浮液分给相应标记的固体介质琼脂板。（图2）
- 使用在乙醇中灭菌、通过 Bunsen 燃烧器火焰并通过接触琼脂表面冷却的细胞扩张器，将 100 μL 的细胞悬浮液扩散，直到琼脂板表面变干。
- 在支持细菌生长的温度下倒置孵育扩散板。在这里，大肠杆菌在37°C孵育。
- 孵育后，一旦出现可见的菌落，计算每个板块上的细菌菌落数量，并记录这些值以及每个时间点所有板的相关稀释系数。
- 生长条件设置
- 媒体接种
3. 数据分析和结果
- 光密度 （OD600） 增长曲线图
- 在半对数尺度上绘制光学密度 （OD600） 与时间。（图3）
- 菌落形成单元 （CFU/mL） 生长曲线图
- 对于每个时间点，选择菌落计数在 30-300 细菌范围内的稀释板。将菌群计数数乘以稀释系数，再乘以 10，因为 100 μL 差差在计算 CFU/mL 时被视为额外的 1：10 稀释。
- 在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。（图4）
- 对于每个时间点，选择菌落计数在 30-300 细菌范围内的稀释板。将菌群计数数乘以稀释系数，再乘以 10，因为 100 μL 差差在计算 CFU/mL 时被视为额外的 1：10 稀释。
- 相关光学密度和菌落形成单元
- 在小于或等于 1.0 OD600 的 OD600 读数的线性刻度上绘制菌落成形单元与光学密度，因为 OD600 和 CFU/mL 之间的关系在 1.0 OD600 之后的精确度较低。此处绘制了前六个时间点。（图5）
- 生成显示方程和 R2值的线性回归趋势线。
- 确定细菌翻倍时间
- 使用菌落形成单位生长曲线图，在指数相中，在图形上识别两个点，它们之间的斜率最陡，以计算倍增时间。
- 计算加倍时间
- • 时间= t2 - t1，其中t1 = 时间点 1 和t2 = 时间点 2
-
，其中b = t2的细菌数，B = t1的细菌数，n = 代数的细菌数。 派生自： .
- 使用：
，其中b = t2的细菌数，B = t1的细菌数，n = 代数的细菌数。 派生自： 细菌通过称为细胞分裂的过程繁殖，导致两个相同的子细胞。如果生长条件有利，细菌数量将呈指数级增长。
细菌生长曲线绘制培养物中的细菌量作为时间的函数。典型的生长曲线通过四个阶段进行：滞后阶段、指数相、固定相和死亡阶段。滞后阶段是细菌到达一种可以迅速生长和分裂的状态所需的时间。在此之后，细菌过渡到指数阶段，其特点是细胞快速生长和分裂。在此阶段，细菌培养的指数增长率可以表示为倍增时间，这是细菌在特定条件下繁殖的最快速度。下一个阶段是固定阶段，细菌细胞生长停滞，由于环境营养枯竭，生长和死亡率甚至达到平衡。最后，细菌进入死亡阶段。这是细菌生长急剧下降和严重的营养消耗导致细胞的溶化。
两种技术可用于量化培养中细菌的数量，并绘制生长曲线。第一种是通过殖民地形成单位，或CFU。为了获得 CCF，在常规时间点执行一到十个系列的九稀释。本例中的第一种稀释剂为负数，含有9mL的PBS和1mL的细菌培养物。导致 1：10 稀释系数。然后，将1mL的溶液转移到下一管，负2，产生1：100稀释系数。这个过程通过最后一个管，负九，导致最终稀释系数为1：10亿。在此之后，每个稀释100微升被镀。然后孵育板，并计算克隆菌落。在 30 到 300 个菌落之间生长的给定时间点的稀释板用于计算该时间点的每毫升 CCF。
测量细菌浓度的第二种常用方法是光学密度。与介质空白相关的文化光密度可以通过分光光度计立即测量。通常，600 纳米的波长（也称为 OD600）用于这些测量，这些测量会随着细胞密度的增加而增加。虽然光学密度不如CCF，但它很方便，因为它可以即时获得，并且需要的试剂相对较少。这两种技术可以一起使用来创建一个标准曲线，该曲线可以更准确地近似于培养物的细菌细胞计数。在本视频中，您将学习如何从大肠杆菌的时序稀释中获得CCF和OD600测量值。然后，使用 CFU 和 OD600 测量值分别绘制两个增长曲线，然后由标准曲线关联。
在处理细菌时，使用适当的个人防护设备（如实验室外套和手套）并遵循适当的无菌技术非常重要。
之后，用70%乙醇对工作站进行消毒。首先，在单独的高压灭菌瓶中制备 LB 肉汤和 LB 固体琼脂介质。部分关闭瓶盖后，在设定温度为 121 摄氏度的高压灭菌器中对介质进行消毒 35 分钟。接下来，让琼脂介质在设定在50摄氏度的水浴中冷却30分钟。冷却后，将 20 至 25 mL 倒入每个培养皿中。在此之后，让板在室温下设置 24 小时。
为了准备一个殖民地分离物，以后将被用于产生液体细菌培养物，请使用先前冷冻的库存和适当的条纹电镀技术，将大肠杆菌条纹在LB琼脂上分离。在37摄氏度的温度下孵育一夜之间。在此之后，冷却琼脂上的火焰灭菌接种回路，然后从带条纹的板上选择单个菌落。在 15 mL 试管中接种 4 mL 的液体介质。然后，在37摄氏度的温度下生长大肠杆菌，在210rpm下摇动。
要设置生长曲线中使用的1：1000体积的细菌培养物，首先获得一个500 mL Erlenmeyer烧瓶的高压灭菌。然后，使用 50 mL 血清学移液器将 100 mL 无菌介质转移到烧瓶。接下来，连续将 9 个 15 ml 试管标记为 1 到 9。这些数字对应于用于计算菌落形成单位或 CFU 的稀释系数。然后，将 9 mL 的 1X PBS 添加到每个管中。在此之后，用相应的时间点和将生长的稀释因子标记准备好的琼脂板。在大肠杆菌的这个例子中，在起始时间点之后，每小时服用一次时间点。使用先前制备的隔夜液体大肠杆菌培养基，在高压灭菌管 500 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种培养基，培养体积为 1：1000。旋转介质以均匀分布细菌。
遮蔽分光光度计后，用无绒擦拭清洁比色皿。接下来，将 1 mL 的培养体放入比色皿中，并将其放入分光光度计，以获得点零时培养的光学密度。然后，在37摄氏度的温度下生长大肠杆菌，在210rpm下摇动。在每个时间点后零点，从烧瓶中取出另外1 mL的细菌培养物，并重复光学密度测量。如果光学密度读数大于 1.0，则用 900 微升的新鲜介质稀释 100 微升细菌培养，然后再次测量光学密度。对于 OD 600 测量，此值可以乘以 10。
要获得每个时间点的菌落形成单位测量，请在每个时间点从烧瓶中再提取 1 mL 的细菌培养物。将细菌培养物放入负一试管和涡旋中混合。然后，首先将负一管中的1 mL转移到负二管和涡旋中混合，从而执行稀释系列。将 1 mL 从负 2 管转移到负三管和涡旋混合。继续这个串行转移下来所有的稀释管到负九管。将100微升的细胞悬浮液放在相应的标签板上，用于每次稀释。对于每一次稀释，对乙醇中的细胞扩散器进行消毒，通过Bunsen燃烧器火焰将其传递，然后通过接触远离接种的琼脂表面来冷却。然后，使用细胞扩张器分散细胞悬浮液，直到琼脂板表面变干。在37摄氏度的温度下孵育这些板块。一旦出现可见的菌落，计算每个盘子上的细菌菌落数量。在每个时间点记录每个板的这些值及其相关的稀释系数。
要创建 OD 600 增长曲线，在确保所有数据点正确输入到表中后，选择所有时间点及其相应数据。要生成菌落形成单位生长曲线图，请选择每个时间点的菌落计数在 30 到 300 细菌范围内的稀释板。将菌落计数数乘以稀释系数，再乘以 10。这是因为在计算每毫升的菌落形成单位时，100微升的分布被认为是额外的1：10稀释。在此之后，在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。
这些分别采用OD 600和CFU测量的地块可以提供有关大肠杆菌生长动力学的宝贵信息。光学密度和菌落形成单元可以相关，因此可以从 OD 600 测量中估计每毫升的 CCF，从而在将来的实验中节省时间和材料。
为此，在 OD 600 读数小于或等于 1 的线性刻度上，根据光学密度绘制菌落成形单元。0. 在此之后，以 Y = MX + B 格式生成线性回归趋势线，其中 M 是斜率，B 为 y 截距。右键单击数据点并选择添加趋势线和线性。然后，选中此框以在图表上显示公式，并在图表上显示 R 平方值。R 平方值是数据与拟合回归线匹配程度的统计度量。在此示例中，前 6 个时间点在 x 轴上绘制 OD 600，y 轴上每毫升的 CCF。在未来具有相同生长条件的实验中，这些斜率和 y 截距值可以插入此方程中，以从 OD 600 读数中估计 CCF。接下来，查看形成单位增长曲线图的殖民地。在指数相中，确定两个时间点之间的斜率最陡。要计算倍增时间，首先计算所选时间点之间的时间变化。然后，使用此处所示的方程计算代数变化。此处，小写 b 是时间点 3 处的细菌数量，大写 B 是时间点 2 的细菌数。最后，将时间变化除以代代变化。在此示例中，加倍时间为 0。26小时或15分19秒比较不同实验治疗的倍数，使我们能够确定特定细菌物种的最佳生长条件。因此，具有最低双倍时间的治疗将是测试条件的最佳选择。
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Results
菌群形成单位和光学密度的图是可视化生长动力学的两种方法。通过确定 CFU/mL 和 OD600 之间的关系，光学密度图还提供了 CFU/mL 随时间的估计值。导致最短倍增时间的条件被认为是特定细菌生长的最佳条件。
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Applications and Summary
生长曲线对于了解细菌的生长动力学和生理学有价值。它们使我们能够确定细菌在可变生长条件下的反应，并为给定细菌定义最佳生长参数。菌落形成单位和光密度图都包含有价值的信息，描述了滞后阶段的持续时间，达到的最大细胞密度，并允许计算细菌倍增时间。生长曲线还允许在相同的生长条件下对不同细菌进行比较。此外，光学密度提供了一种标准化初始接种的方法，提高了其他实验中的一致性。
在设计增长曲线实验时，需要考虑使用哪种方法。作为生成生长曲线的首选方法，菌落形成单位图更准确地反映了批次培养中的可行细胞计数。菌落形成单位图还允许测量细菌生长的条件，否则会干扰光学密度测量。然而，这是一个更耗时的过程，需要广泛使用试剂，必须手动执行。光学密度图不太准确，仅提供菌落形成单位的估计值，需要为每个独特的细菌生成标准曲线。光学密度主要用于方便，因为它省时少，不需要很多试剂来工作。对光学密度最有吸引力的是，分光光度培养箱可以自动生成生长曲线，大大增加可立即测试的培养条件数量，并无需不断参与培养。
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References
- R. E. Buchanan. 1918. Life Phases in a Bacterial Culture. J Infect Dis 23:109-125.
- CAMPBELL A. 1957. Synchronization of cell division. Bacteriol Rev 21:263-72.
- Wang P, Robert L, Pelletier J, Dang WL, Taddei F, Wright A, Jun S. 2010. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol 20:1099-103.
- Goldman E, Green LH. 2015. Practical Handbook of Microbiology, Third Edition. CRC Press.
- Ben-David A, Davidson CE. 2014. Estimation method for serial dilution experiments. J Microbiol Methods 107:214-221.
- Koch AL. 1968. Theory of the angular dependence of light scattered by bacteria and similar-sized biological objects. J Theor Biol 18:133-156.
- Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R. 2007. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol 189:8746-9.
