Wachstumskurven: Erzeugen von Wachstumskurven mit Hilfe von koloniebildenden Einheiten und Messungen der optischen Dichte

Bakterien vermehren sich durch einen Prozess namens Zellteilung, was zu zwei identischen Tochterzellen führt. Wenn die Wachstumsbedingungen günstig sind, werden Bakterienpopulationen exponentiell wachsen.

Bakterielle Wachstumskurven zeichnen die Menge an Bakterien in einer Kultur als Funktion der Zeit. Eine typische Wachstumskurve verläuft in vier Stufen: Verzögerungsphase, Exponentialphase, stationäre Phase und Todesphase. Die Verzögerungsphase ist die Zeit, die Bakterien braucht, um einen Zustand zu erreichen, in dem sie schnell wachsen und sich teilen können. Danach übergehen die Bakterien in die exponentielle Phase, die durch schnelles Zellwachstum und Division gekennzeichnet ist. Die Rate des exponentiellen Wachstums der Bakterienkultur während dieser Phase kann als die Verdoppelungszeit ausgedrückt werden, die schnellste Rate, mit der sich Bakterien unter bestimmten Bedingungen vermehren können. Als nächstes folgt die stationäre Phase, in der das Wachstum der Bakterienzellen und die Wachstums- und Sterberaten aufgrund des Nährstoffmangels in der Umwelt ausgeglichen sind. Schließlich treten die Bakterien in die Todesphase ein. Hier nimmt das Bakterienwachstum stark ab und ein starker Nährstoffmangel führt zur Lysierung der Zellen.

Zwei Techniken können verwendet werden, um die Menge der Bakterien in einer Kultur zu quantifizieren und eine Wachstumskurve zu zeichnen. Die erste davon ist über koloniebildende Einheiten, oder KBE. Um KBE zu erhalten, wird eine ein bis zehn Reihe von neun Verdünnungen zu regulären Zeitpunkten durchgeführt. Die erste dieser Verdünnungen, negative in diesem Beispiel, enthält 9ml PBS und 1ml der Bakterienkultur. Daraus ergibt sich ein Verdünnungsfaktor von 1:10. Dann werden 1ml dieser Lösung auf die nächste Röhre übertragen, negative zwei, was zu einem Verdünnungsfaktor von 1:100 führt. Dieser Prozess setzt sich durch die letzte Röhre, negative neun, was zu einem endgültigen Verdünnungsfaktor von 1:1 Milliarden führt. Danach werden 100 Mikroliter jeder Verdünnung plattiert. Die Platten werden dann inkubiert und die Klonkolonien gezählt. Die Verdünnungsplatte für einen bestimmten Zeitpunkt, der zwischen 30 und 300 Kolonien wächst, wird verwendet, um die KBE pro Milliliter für diesen Zeitpunkt zu berechnen.

Die zweite gängige Methode zur Messung der bakteriellen Konzentration ist die optische Dichte. Die optische Dichte einer Kultur kann sofort gemessen werden, in Relation zu einem Medienrohling, mit einem Spektralphotometer. Typischerweise wird für diese Messungen eine Wellenlänge von 600 Nanometern, auch OD600 genannt, verwendet, die mit zunehmender Zelldichte zunehmen. Die optische Dichte ist zwar weniger präzise als KBE, ist aber praktisch, da sie sofort erhalten werden kann und relativ wenige Reagenzien benötigt. Beide Techniken können zusammen verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die die Anzahl der bakteriellen Zellen einer Kultur genauer annähert. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie KBE- und OD600-Messungen aus zeitierten seriellen Verdünnungen von E. colierhalten. Anschließend werden zwei Wachstumskurven mit den CFU- bzw. OD600-Messungen dargestellt, bevor sie durch eine Standardkurve verknüpft werden.

Bei der Arbeit mit Bakterien ist es wichtig, die entsprechende persönliche Schutzausrüstung wie Labormantel und Handschuhe zu verwenden und die richtige aseptische Technik zu beachten.

Danach sterilisieren Sie den Arbeitsplatz mit 70% Ethanol. Bereiten Sie zunächst die LB-Brühe und LB-Festagarmedien in separaten autoklavierbaren Flaschen vor. Nachdem Sie die Kappen der Flaschen teilweise geschlossen haben, sterilisieren Sie die Medien in einem Autoklaven, der 35 Minuten auf 121 Grad Celsius eingestellt ist. Als nächstes lassen Sie die Agar-Medien in einem Wasserbad auf 50 Grad Celsius für 30 Minuten abkühlen. Nach dem Abkühlen 20 bis 25 ml in jede Petrischale gießen. Danach lassen Sie die Platten für 24 Stunden bei Raumtemperatur einstellen.

Um die einzelnen Kolonieisolate vorzubereiten, die später verwendet werden, um eine flüssige Bakterienkultur zu produzieren, verwenden Sie zuvor gefrorenen Bestand und richtige Streifenbeschichtungstechnik, um E. coli zur Isolierung auf LB-Agar zu streifen. Inkubieren Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius über Nacht. Danach eine flammsterilisierte Impfschleife auf dem Agar abkühlen, bevor sie eine einzelne Kolonie aus der gestreiften Platte auswählen. 4 ml flüssige Medien in einem 15 ml Reagenzglas impfen. Dann wachsen die E. coli bei 37 Grad Celsius über Nacht mit Schütteln bei 210 U/min.

Um das 1:1000 Volumen der Bakterienkultur einzurichten, das in der Wachstumskurve verwendet wird, erhalten Sie zunächst einen autoklavierten 500 mL Erlenmeyer Kolben. Verwenden Sie dann eine 50 ml serologische Pipette, um 100 ml sterile Medien in den Kolben zu übertragen. Als nächstes etikettieren Sie neun 15 ml Reagenzgläser nacheinander als eins bis neun. Diese Zahlen entsprechen dem Verdünnungsfaktor, der zur Berechnung der Koloniebildenden Einheit (KBE) verwendet wird. Fügen Sie dann 9 ml 1X PBS zu jedem Rohr hinzu. Danach beschriften Sie die vorbereiteten Agarplatten mit den entsprechenden Zeitpunkten und Verdünnungsfaktoren, die angebaut werden. In diesem Beispiel mit E. coliwerden nach dem Startzeitpunkt einmal pro Stunde Zeitpunkte genommen. Mit der zuvor vorbereiteten über Nacht flüssigen E. coli-Kultur, impfen die Medien im Autoklaven 500 mL Erlenmeyer Kolben mit 1:1000 Volumen der Kultur. Wirbeln Sie die Medien, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen.

Nach dem Ausblenden eines Spektralphotometers die Küvette mit einem fusselfreien Wischtuch reinigen. Als nächstes geben Sie 1 ml der Kultur in die Küvette und legen Sie sie in das Spektralphotometer, um die optische Dichte der Kultur zum Zeitpunkt Null zu erhalten. Dann wachsen die E. coli bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 210 U/min. Zu jedem Zeitpunkt Punkt nach Zeitpunkt Null, ziehen Sie weitere 1 ml Bakterienkultur aus dem Kolben und wiederholen Sie die optische Dichtemessung. Wenn die optische Dichte abwertt größer als 1,0 ist, verdünnen Sie 100 Mikroliter Bakterienkultur mit 900 Mikroliter frischer Medien und messen Sie dann die optische Dichte erneut. Dieser Wert kann für die OD 600-Messung mit 10 multipliziert werden.

Um die Koloniebildende Einheitsmessung für jeden Zeitpunkt zu erhalten, ziehen Sie zu jedem Zeitpunkt eine zusätzliche 1 ml Bakterienkultur aus dem Kolben ab. Geben Sie die Bakterienkultur in das negative reagenzchen und Wirbel zum Mischen. Führen Sie dann die Verdünnungsserie durch, indem Sie zuerst 1 ml von der negativen ein Röhre in die negative zwei Röhre und Wirbel übertragen, um zu mischen. Übertragen Sie 1 ml aus dem negativen zwei Rohr in die negative drei Rohr und Wirbel zu mischen. Setzen Sie diese serielle Übertragung nach unten alle Verdünnungsrohre auf die negative neun Rohr. 100 Mikroliter Zellsuspension für jede Verdünnung auf die entsprechend beschriftete Platte geben. Sterilisieren Sie für jede Verdünnung einen Zellstreuer in Ethanol, passieren Sie ihn durch eine Bunsenbrennerflamme und kühlen Sie ihn, indem Sie die Oberfläche des Agars vom Impfmittel weg berühren. Verwenden Sie dann den Zellstreuer, um die Zellsuspension zu verteilen, bis die Oberfläche der Agarplatte trocken wird. Die Platten bei 37 Grad Celsius auf den Kopf stellen. Sobald sichtbare Kolonien entstehen, zählen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien auf jeder Platte. Zeichnen Sie diese Werte und die zugehörigen Verdünnungsfaktoren für jede Platte zu jedem Zeitpunkt auf.

Um eine OD 600-Wachstumskurve zu erstellen, nachdem Sie sichergestellt haben, dass alle Datenpunkte korrekt in eine Tabelle eingegeben werden, wählen Sie alle Zeitpunkte und die entsprechenden Daten aus. Um ein koloniebildendes Einheitenwachstumskurvendiagramm zu erzeugen, wählen Sie die Verdünnungsplatte, bei der die Koloniezählungen innerhalb des Bereichs von 30 bis 300 Bakterien für jeden Zeitpunkt fielen. Multiplizieren Sie die Kolonieanzahl mit dem Verdünnungsfaktor und dann mit zehn. Dies liegt daran, dass die 100 Mikroliter-Streuung bei der Berechnung von Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter als zusätzliche Verdünnung von 1:10 betrachtet wird. Danach zeichnen Sie die Kolonie bildenden Einheiten im Vergleich zur Zeit auf einer Halblogskala.

Diese mit OD 600 bzw. CFU-Messungen erstellten Parzellen können wertvolle Informationen über die E. coli-Wachstumskinetik liefern. Die optischedichte und koloniebildende Einheit kann miteinander verknüpft werden, so dass KBE pro Milliliter aus OD 600 Messungen geschätzt werden können, was Zeit und Materialien in zukünftigen Experimenten spart.

Um dies zu tun, zeichnen Sie die Kolonie bildenden Einheiten gegen die optische Dichte auf einer linearen Skala für OD 600-Werte kleiner oder gleich 1. 0. Danach generieren Sie eine lineare Regressionstrendlinie im Y = MX + B-Format, wobei M die Steigung und B der y-Abfangpunkt ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datenpunkte und wählen Sie Trendlinie und Linear hinzufügen aus. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen, um die Gleichung im Diagramm anzuzeigen und den R-Quadratwert im Diagramm anzuzeigen. Der R-Quadratwert ist die statistische Messung, wie eng die Daten mit der angepassten Regressionslinie übereinstimmen. In diesem Beispiel werden die ersten 6 Zeitpunkte mit OD 600 auf der x-Achse und KBE pro Milliliter auf der y-Achse dargestellt. In zukünftigen Experimenten mit den gleichen Wachstumsbedingungen können diese Neigungs- und y-Abfangwerte in diese Gleichung eingesteckt werden, um KBE aus OD 600-Werten zu schätzen. Sehen Sie sich als Nächstes das Koloniebild-Wachstumskurvendiagramm an. Identifizieren Sie während der Exponentialphase zwei Zeitpunkte mit der steilsten Neigung zwischen ihnen. Um die Verdoppelungszeit zu berechnen, berechnen Sie zunächst die Zeitänderung zwischen den ausgewählten Zeitpunkten. Berechnen Sie dann die Generationsänderung anhand der hier gezeigten Gleichung. Hier ist Kleinbuchstabe b die Anzahl der Bakterien zum Zeitpunkt 3 und Großbuchstabe B die Anzahl der Bakterien zum Zeitpunkt zwei. Schließlich teilen Sie die Veränderung in der Zeit durch den Generationswechsel. In diesem Beispiel ist die Verdoppelungszeit 0. 26 Stunden oder 15 Minuten und 19 Sekunden. Der Vergleich der Verdoppelungszeiten bei verschiedenen experimentellen Behandlungen ermöglicht es uns, die besten Wachstumsbedingungen für eine bestimmte Bakterienart zu identifizieren. Daher wird die Behandlung mit der niedrigsten Verdoppelungszeit am optimalsten der getesteten Bedingungen sein.