Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线
 

生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

细菌通过称为细胞分裂的过程繁殖,导致两个相同的子细胞。如果生长条件有利,细菌数量将呈指数级增长。

细菌生长曲线绘制培养物中的细菌量作为时间的函数。典型的生长曲线通过四个阶段进行:滞后阶段、指数相、固定相和死亡阶段。滞后阶段是细菌到达一种可以迅速生长和分裂的状态所需的时间。在此之后,细菌过渡到指数阶段,其特点是细胞快速生长和分裂。在此阶段,细菌培养的指数增长率可以表示为倍增时间,这是细菌在特定条件下繁殖的最快速度。下一个阶段是固定阶段,细菌细胞生长停滞,由于环境营养枯竭,生长和死亡率甚至达到平衡。最后,细菌进入死亡阶段。这是细菌生长急剧下降和严重的营养消耗导致细胞的溶化。

两种技术可用于量化培养中细菌的数量,并绘制生长曲线。第一种是通过殖民地形成单位,或CFU。为了获得 CCF,在常规时间点执行一到十个系列的九稀释。本例中的第一种稀释剂为负数,含有9mL的PBS和1mL的细菌培养物。导致 1:10 稀释系数。然后,将1mL的溶液转移到下一管,负2,产生1:100稀释系数。这个过程通过最后一个管,负九,导致最终稀释系数为1:10亿。在此之后,每个稀释100微升被镀。然后孵育板,并计算克隆菌落。在 30 到 300 个菌落之间生长的给定时间点的稀释板用于计算该时间点的每毫升 CCF。

测量细菌浓度的第二种常用方法是光学密度。与介质空白相关的文化光密度可以通过分光光度计立即测量。通常,600 纳米的波长(也称为 OD600)用于这些测量,这些测量会随着细胞密度的增加而增加。虽然光学密度不如CCF,但它很方便,因为它可以即时获得,并且需要的试剂相对较少。这两种技术可以一起使用来创建一个标准曲线,该曲线可以更准确地近似于培养物的细菌细胞计数。在本视频中,您将学习如何从大肠杆菌的时序稀释中获得CCF和OD600测量值。然后,使用 CFU 和 OD600 测量值分别绘制两个增长曲线,然后由标准曲线关联。

在处理细菌时,使用适当的个人防护设备(如实验室外套和手套)并遵循适当的无菌技术非常重要。

之后,用70%乙醇对工作站进行消毒。首先,在单独的高压灭菌瓶中制备 LB 肉汤和 LB 固体琼脂介质。部分关闭瓶盖后,在设定温度为 121 摄氏度的高压灭菌器中对介质进行消毒 35 分钟。接下来,让琼脂介质在设定在50摄氏度的水浴中冷却30分钟。冷却后,将 20 至 25 mL 倒入每个培养皿中。在此之后,让板在室温下设置 24 小时。

为了准备一个殖民地分离物,以后将被用于产生液体细菌培养物,请使用先前冷冻的库存和适当的条纹电镀技术,将大肠杆菌条纹在LB琼脂上分离。在37摄氏度的温度下孵育一夜之间。在此之后,冷却琼脂上的火焰灭菌接种回路,然后从带条纹的板上选择单个菌落。在 15 mL 试管中接种 4 mL 的液体介质。然后,在37摄氏度的温度下生长大肠杆菌,在210rpm下摇动。

要设置生长曲线中使用的1:1000体积的细菌培养物,首先获得一个500 mL Erlenmeyer烧瓶的高压灭菌。然后,使用 50 mL 血清学移液器将 100 mL 无菌介质转移到烧瓶。接下来,连续将 9 个 15 ml 试管标记为 1 到 9。这些数字对应于用于计算菌落形成单位或 CFU 的稀释系数。然后,将 9 mL 的 1X PBS 添加到每个管中。在此之后,用相应的时间点和将生长的稀释因子标记准备好的琼脂板。在大肠杆菌的这个例子中,在起始时间点之后,每小时服用一次时间点。使用先前制备的隔夜液体大肠杆菌培养基,在高压灭菌管 500 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种培养基,培养体积为 1:1000。旋转介质以均匀分布细菌。

遮蔽分光光度计后,用无绒擦拭清洁比色皿。接下来,将 1 mL 的培养体放入比色皿中,并将其放入分光光度计,以获得点零时培养的光学密度。然后,在37摄氏度的温度下生长大肠杆菌,在210rpm下摇动。在每个时间点后零点,从烧瓶中取出另外1 mL的细菌培养物,并重复光学密度测量。如果光学密度读数大于 1.0,则用 900 微升的新鲜介质稀释 100 微升细菌培养,然后再次测量光学密度。对于 OD 600 测量,此值可以乘以 10。

要获得每个时间点的菌落形成单位测量,请在每个时间点从烧瓶中再提取 1 mL 的细菌培养物。将细菌培养物放入负一试管和涡旋中混合。然后,首先将负一管中的1 mL转移到负二管和涡旋中混合,从而执行稀释系列。将 1 mL 从负 2 管转移到负三管和涡旋混合。继续这个串行转移下来所有的稀释管到负九管。将100微升的细胞悬浮液放在相应的标签板上,用于每次稀释。对于每一次稀释,对乙醇中的细胞扩散器进行消毒,通过Bunsen燃烧器火焰将其传递,然后通过接触远离接种的琼脂表面来冷却。然后,使用细胞扩张器分散细胞悬浮液,直到琼脂板表面变干。在37摄氏度的温度下孵育这些板块。一旦出现可见的菌落,计算每个盘子上的细菌菌落数量。在每个时间点记录每个板的这些值及其相关的稀释系数。

要创建 OD 600 增长曲线,在确保所有数据点正确输入到表中后,选择所有时间点及其相应数据。要生成菌落形成单位生长曲线图,请选择每个时间点的菌落计数在 30 到 300 细菌范围内的稀释板。将菌落计数数乘以稀释系数,再乘以 10。这是因为在计算每毫升的菌落形成单位时,100微升的分布被认为是额外的1:10稀释。在此之后,在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。

这些分别采用OD 600和CFU测量的地块可以提供有关大肠杆菌生长动力学的宝贵信息。光学密度和菌落形成单元可以相关,因此可以从 OD 600 测量中估计每毫升的 CCF,从而在将来的实验中节省时间和材料。

为此,在 OD 600 读数小于或等于 1 的线性刻度上,根据光学密度绘制菌落成形单元。0. 在此之后,以 Y = MX + B 格式生成线性回归趋势线,其中 M 是斜率,B 为 y 截距。右键单击数据点并选择添加趋势线和线性。然后,选中此框以在图表上显示公式,并在图表上显示 R 平方值。R 平方值是数据与拟合回归线匹配程度的统计度量。在此示例中,前 6 个时间点在 x 轴上绘制 OD 600,y 轴上每毫升的 CCF。在未来具有相同生长条件的实验中,这些斜率和 y 截距值可以插入此方程中,以从 OD 600 读数中估计 CCF。接下来,查看形成单位增长曲线图的殖民地。在指数相中,确定两个时间点之间的斜率最陡。要计算倍增时间,首先计算所选时间点之间的时间变化。然后,使用此处所示的方程计算代数变化。此处,小写 b 是时间点 3 处的细菌数量,大写 B 是时间点 2 的细菌数。最后,将时间变化除以代代变化。在此示例中,加倍时间为 0。26小时或15分19秒比较不同实验治疗的倍数,使我们能够确定特定细菌物种的最佳生长条件。因此,具有最低双倍时间的治疗将是测试条件的最佳选择。

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter