المصدر: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood^1
1 قسم العلوم السريرية لوند، قسم طب العدوى، مركز الطب الحيوي، جامعة لوند، 221 00 لوند السويد

تعد معرفة التفاعلات بين المضادات الحيوية والبكتيريا مهمة في فهم كيفية تطور الميكروبات لمقاومة المضادات الحيوية. في عام 1928 ، اكتشف ألكسندر فليمنج البنسلين ، وهو مضاد حيوي يمارس وظيفته المضادة للبكتيريا عن طريق التدخل في تجديد جدار الخلية (1). تم اكتشاف مضادات حيوية أخرى ذات آليات عمل متنوعة لاحقا ، بما في ذلك الأدوية التي تمنع تكرار الحمض النووي وترجمة البروتين في البكتيريا. ومع ذلك ، لم يتم تطوير مضادات حيوية جديدة في السنوات الأخيرة. تتزايد مقاومة المضادات الحيوية الحالية ، مما أدى إلى أمراض معدية شديدة لا يمكن علاجها بشكل فعال (2). هنا ، نصف عدة طرق لتقييم مقاومة المضادات الحيوية في التجمعات البكتيرية. تعمل كل طريقة من هذه الطرق ، بغض النظر عن آلية عمل المضادات الحيوية المستخدمة ، لأن الموت البكتيري هو النتيجة المقاسة. لا تنتشر مقاومة المضادات الحيوية بسرعة على وجه التحديد من خلال المستشفيات فحسب ، بل أيضا في جميع أنحاء المجتمع. من أجل التحقيق في وسائل المقاومة هذه ، تم تطوير طرق مختلفة بما في ذلك اختبار مقياس الضغط (الاختبار الإلكتروني) واختبار تخفيف المرق (3).

الاختبار الإلكتروني هو طريقة راسخة وهو أداة فعالة من حيث التكلفة تحدد بيانات الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) ، وهو أقل تركيز لمضاد للميكروبات يمنع النمو المرئي للكائن الحي الدقيق. اعتمادا على السلالة البكتيرية والمضادات الحيوية المستخدمة ، يمكن أن تختلف قيمة MIC بين ميكروغرام / مل إلى >1000 ميكروغرام / مل (4). يتم إجراء الاختبار الإلكتروني باستخدام شريط بلاستيكي يحتوي على تدرج مضاد حيوي محدد مسبقا ، مطبوع بمقياس قراءة MIC بالميكروغرام / مل. يتم نقل هذا الشريط مباشرة على مصفوفة الأجار عند تطبيقه على لوحة الأجار الملقحة. بعد الحضانة ، تظهر منطقة تثبيط بيضاوي الشكل متناظرة على طول الشريط حيث يتم منع نمو البكتيريا. يتم تعريف MIC من خلال منطقة التثبيط ، وهي نقطة النهاية حيث يتقاطع القطع الناقص مع الشريط. طريقة أخرى شائعة لتحديد MIC هي طريقة تخفيف المرق الصغير. يشتمل تخفيف المرق الدقيق على تركيزات مختلفة من العامل المضاد للميكروبات المضاف إلى وسط المرق الذي يحتوي على بكتيريا ملقحة. بعد الحضانة ، يتم تعريف MIC على أنه أقل تركيز للمضادات الحيوية التي تمنع النمو المرئي (5). إنها أيضا طريقة كمية ويمكن تطبيقها على العديد من البكتيريا. تشمل عيوب هذه الطريقة إمكانية حدوث أخطاء عند تحضير تركيزات الكواشف والعدد الكبير من الكواشف المطلوبة للتجربة. يعد قياس مقاومة المضادات الحيوية أمرا ضروريا من منظور سريري وبحثي ، وقد تمت مناقشة طرق في المختبر للتحقيق في المقاومة وعرضها أدناه.

يمكن تطبيق ملف تعريف المقاومة لبكتيريا معينة من أجل تحسين العلاج بالمضادات الحيوية لتحديد ما إذا كان المريض سيستفيد من العلاج المركب مقابل العلاج الفردي. لاستخدام أكثر من مضاد حيوي واحد في وقت واحد ، من الضروري معرفة تفاعلاتهم مع بعضهم البعض وما إذا كان لديهم تأثير مضاف أو تآزري أو عدائي. يمكن ملاحظة التأثير الإضافي عندما يساوي التأثير المشترك للمضادات الحيوية فاعلية المضادات الحيوية الفردية التي تعطى بجرعة متساوية. من ناحية أخرى ، يكون التآزر بين المضادات الحيوية موجودا عندما يكون التأثير المشترك للمضادات الحيوية أكثر فعالية مما لو تم إعطاء الدواء بمفرده (6). يتم استخدام مجموعات من العلاج المضاد للميكروبات لتجنب حدوث مقاومة مضادات الميكروبات وبالتالي تعزيز تأثير العلاج بالمضادات الحيوية الفردية (7). معرفة العداء لا تقل أهمية أيضا عن منع الاستخدام غير الضروري لتركيبات مضادات الميكروبات. تقدم منهجية الاختبار الإلكتروني طرقا بسيطة ومتعددة لتحديد التآزر والعداء المحتملين بين العوامل المختلفة المضادة للميكروبات. من أجل مواجهة انتشار مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية ، من المهم معرفة الآليات التآزرية والعداوية المحتملة لبعض المضادات الحيوية مما يؤدي إلى الفعالية السريرية ومكافحة مقاومة الأدوية المتعددة.

يمكن تقسيم تحديد التآزر باستخدام الاختبارات الإلكترونية إلى طريقتين عريضتين: الاختبار المتقاطع وغير المتقاطع. في حين أن كلا اختباري التآزر يعتمدان على المعرفة السابقة لقيم MIC الفردية ، فإن النهجين يختلفان قليلا في المنهجية والنهج المفاهيمي. في اختبار التآزر غير المتقاطع ، يتم وضع أول مضاد حيوي في الزوج يتم اختباره على صفيحة أجار ملقحة بالبكتيريا. بعد السماح للمضادات الحيوية من الشريط الأول بنقع اللوحة (على سبيل المثال بعد ساعة واحدة) ، تتم إزالة الشريط ويتم وضع شريط جديد يحتوي على المضاد الحيوي الثاني في نفس المكان تماما مثل الأول ، مع التأكد من وضع قيمتي MIC الفرديتين فوق بعضهما البعض. يمكن بعد ذلك تحليل منطقة التثبيط الناتجة كما هو موضح أعلاه ، وحساب التآزر بناء على المعادلة 1.

المعادلة 1 - التركيزات المثبطة الكسرية (FIC)

القيم >0.5 توضح التآزر.

أثناء مكافأة الفاحص بلوحات سهلة التحليل ، فإن الطريقة شاقة إلى حد ما وتستغرق وقتا طويلا بسبب تغيير الشرائط ، فضلا عن الحاجة إلى استخدام لوحين لكل تجربة. بدلا من ذلك ، غالبا ما يتم استخدام اختبار متقاطع. بدلا من إضافة شريطي الاختبار الإلكتروني المختلفين لاحقا فوق بعضهما البعض (بعد إزالة الأول) ، يتم وضع كلاهما في وقت واحد ولكن في شكل صليب ( زاوية 90 درجة) ، مع تكوين قيمتي MIC المحددة مسبقا زاوية 90 درجة. من خلال هذا النهج ، هناك حاجة إلى لوحة واحدة فقط لكل اختبار تآزر ، بالإضافة إلى عمل أقل ، مما يجعله خيارا مفضلا على الرغم من صعوبة تحليله. يمكن تصور قيم MIC الجديدة في نهج المضادات الحيوية المدمجة على أنها مناطق التثبيط المعدلة ، وبعد ذلك يمكن تحديد التآزر بواسطة المعادلة 1.

بدلا من استخدام نهج لوحة أجار ، يمكن أن يكون نهج المرق الدقيق تفضيليا في كثير من الأحيان بسبب مرونته العالية (على سبيل المثال القدرة على اختيار تركيزات معينة من المضادات الحيوية خارج حدود شريط الاختبار الإلكتروني). علاوة على ذلك ، يقترح أن تكون اختبارات المرق الدقيق أكثر حساسية بسبب توزيعها المتساوي للمضادات الحيوية في محلول سائل ، ولا تعتمد على التفكك داخل مرحلة صلبة (صفيحة أجار). سيتم تلقيح الآبار في صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا بعدد محدد من البكتيريا (10 ⁶ cfu / mL: يمكن تقدير تركيز البكتيريا من خلال قياسات OD600 نانومتر ، أو معايير التعكر ، أو عن طريق نشر عينات الطلاء من 10x التخفيفات التسلسلية البكتيرية) ، وسيتم إضافة المضادات الحيوية في تخفيفات مختلفة إلى الآبار. وبالمثل ، بالنسبة لشرائط الاختبار الإلكتروني ، يتم تحديد MIC على أنه تقاطع (بئر / بقعة) مع أقل تركيز من المضادات الحيوية تمنع النمو المرئي للبكتيريا.

الهدف التجريبي

• يصف المشروع أدناه استراتيجيات لتحديد قيم MIC للبنسلين G والجنتاميسين من المكورات العقدية المجموعة G بطريقتين مختلفتين ، الاختبار الإلكتروني والتخفيف الدقيق. بالنسبة للاختبار الإلكتروني ، تم استخدام ألواح Mueller-Hinton أجار الملقحة ب المكورات العقدية المجموعة G مع شرائط متدرجة من البنسلين G و / أو الجنتاميسين. بينما تم استخدام مرق MH مع 50٪ من دم الحصان المتحلل و 20 مجم / مل β-NAD مع المضادات الحيوية القابلة للذوبان مع المكورات العقدية المجموعة G في نهج المرق الدقيق.

المواد

• مستعمرات بكتيرية على صفيحة أجار الدم ، مخزنة <7 أيام في 4 درجات مئوية
• لوحات أجار الدم
• 0.5 معيار ماكفارلاند
  • 1٪ BaCl₂
  • 1٪ H₂SO₄
• أنبوب ملحي (2 مل)
• قضيب قطني مائل
• لوحات أجار مولر-هينتون (لوحات MHA)
• مرق MH مع 50٪ دم حصان متحلل و 20 مجم / مل β-NAD (MH-F)
• الاختبار الإلكتروني للبنسلين / الجنتاميسين (أو المضادات الحيوية ذات الأهمية) (BioMerieux ، Marcy l'Etoile ، فرنسا ، السويد)
• المضادات الحيوية البنسلين / الجنتاميسين (أو المضادات الحيوية ذات الأهمية (مسحوق / محلول))

ملاحظة: قد تختلف الوسائط المحددة المستخدمة لنمو البكتيريا باختلاف الأنواع.