来源：Anna Bläckberg1, Rolf Lood1
1 瑞典隆德大学隆德临床科学系感染医学部，生物医学中心，隆德 221 00，瑞典
了解抗生素与细菌之间的相互作用对于理解微生物如何进化出抗生素耐药性至关重要。1928年，亚历山大·Fleming（Alexander Fleming）发现了青霉素，这种抗生素通过干扰细菌细胞壁的再生来发挥其抗菌作用（1）。随后，人们又发现了其他具有不同作用机制的抗生素，包括抑制细菌DNA复制和蛋白质翻译的药物；然而，近年来尚未开发出新的抗生素。当前抗生素的耐药性日益增加，导致一些严重的感染性疾病无法得到有效治疗（2）。本文介绍几种评估细菌群体耐药性的方法。这些方法均有效，且不受所用抗生素作用机制的影响，因为其检测的最终指标是细菌的死亡。抗生素耐药性不仅在医院环境中迅速传播，也在整个社会广泛扩散。为了研究此类耐药现象，已发展出多种检测方法，包括Epsilometer试验（E试验）和肉汤稀释法（3）。
E试验是一种成熟的方法，也是一种经济有效的工具，用于量化最小抑菌浓度（MIC）数据，即能够抑制微生物可见生长的抗菌剂的最低浓度。根据所用的细菌菌株和抗生素种类，MIC值可能在亚微克/毫升至>1000 微克/毫升之间变化（4）。E试验使用一种含有预设抗生素梯度的塑料试纸条进行，该试纸条上印有以微克/毫升为单位的MIC读数刻度。当将其应用于接种后的琼脂平板时，试纸条可直接转移至琼脂基质上。经过培养后，由于细菌生长受到抑制，沿试纸条周围可观察到对称的椭圆形抑菌区。MIC由抑菌区域确定，即椭圆与试纸条交界处的刻度值。另一种常用的测定MIC的方法是微量肉汤稀释法。微量肉汤稀释法将不同浓度的抗菌剂加入含接种细菌的液体培养基中。培养后，MIC定义为能够阻止细菌可见生长的最低抗生素浓度（5）。该方法也是一种定量方法，适用于多种细菌。此方法的缺点包括试剂浓度配制过程中可能出现误差，以及实验所需试剂数量较多。从临床和科研角度来看，测定抗生素耐药性至关重要，下文将讨论并展示这些用于研究耐药性的in vitro方法。
针对特定细菌的耐药性谱可用于优化抗生素治疗方案，以确定患者是否能从联合治疗中获益，而非单一药物治疗。同时使用一种以上抗生素时，必须了解它们之间的相互作用，以及它们是否具有相加、协同或拮抗效应。当抗生素联合作用的效果等于各抗生素在相同剂量下单独使用时的效力之和时，即表现为相加效应。而当抗生素的联合作用强于各药物单独使用时的效果，则表明存在协同作用（6）。采用抗菌药物联合治疗旨在避免抗菌药物耐药性的发生，从而增强单个抗生素的治疗效果（7）。了解拮抗作用同样重要，以防止不必要的抗菌药物联合使用。E-test 方法提供了简便且多种途径来确定不同抗菌药物之间可能存在的协同或拮抗作用。为应对耐药病原体的不断蔓延，了解特定抗生素之间可能存在的协同与拮抗机制至关重要，这有助于提高临床疗效并对抗多重耐药性。
使用E-test测定协同作用可分为两大类方法：交叉法和非交叉法。尽管这两种协同试验均依赖于已知的单个抗生素最低抑菌浓度（MIC）值，但它们在方法学和概念上略有不同。在非交叉协同试验中，首先将待测抗生素组合中的第一种抗生素置于接种了细菌的琼脂平板上。在允许第一条试纸中的抗生素扩散入平板一段时间后（例如1小时），移除该试纸，并将含有第二种抗生素的新试纸放置在与第一条完全相同的位置，确保两个试纸各自的MIC值对齐重叠。随后可按照前述方法分析所产生的抑菌圈，并根据公式1计算协同作用。
公式 1 - 抑制分数浓度（FIC）
数值 >0.5 表明具有协同作用。
尽管该方法能为检测者提供易于分析的平板，但由于需要更换试纸条，且每次实验需使用两块平板，因此过程较为繁琐且耗时。取而代之的是，常采用交叉试验法。该方法不再将两种不同的E-test试纸条依次叠加放置（移除第一条后再放置第二条），而是将两条试纸条同时以交叉形式（
90°角）放置，使两条试纸条各自的已知最低抑菌浓度（MIC）值构成直角。通过此方法，每次协同作用检测仅需一块平板，操作更简便，因此尽管分析难度略高，仍为首选方法。联合使用抗生素时的新MIC值可通过观察修饰后的抑菌圈来判断，随后根据公式1确定是否存在协同作用。
与使用琼脂平板法相比，微量肉汤法通常更具优势，因其灵活性更高（例如，可以选择超出E-test试纸条浓度范围的特定抗生素浓度）。此外，由于抗生素在液体溶液中分布均匀，不依赖于在固相（琼脂平板）中的解离过程，微量肉汤法被认为更为敏感。在96孔微孔板的孔中接种定量的细菌（106 cfu/mL：细菌浓度可通过OD600 nm测定、浊度标准或对10倍系列稀释的菌液进行涂布平板法进行估计），并在各孔中加入不同稀释度的抗生素。与E-test试纸条法类似，最低抑菌浓度（MIC）被确定为能够抑制细菌可见生长的最低抗生素浓度所对应的孔/位点。
实验目的
- 以下项目描述了测定青霉素G和庆大霉素MIC值的策略 链球菌 采用两种不同方法对G组进行分组，即E-test和微量肉汤稀释法。对于E-test，使用接种了待测菌的穆勒-希尔顿琼脂平板 链球菌属 G组采用青霉素G和/或庆大霉素梯度条联合使用；而含50%裂解马血的MH肉汤及20 mg/mL β-NAD则与可溶性抗生素联合使用 链球菌 采用微量肉汤法的G组。
材料
- 保存于4°C、<7天内的血琼脂平板上的细菌菌落
- 血琼脂平板
- 0.5麦氏比浊标准
- 1% BaCl2
- 1% H2SO4
- 生理盐水试管（2 mL）
- 棉签
- 穆勒-欣顿琼脂平板（MHA平板）
- 含50%溶血马血和20 mg/mL β-NAD的MH肉汤（MH-F）
- E-test青霉素/庆大霉素（或其他关注的抗生素）（BioMerieux，法国马西莱图瓦勒，瑞典）
- 抗生素青霉素/庆大霉素（或其他关注的抗生素，粉末/溶液）
注意：不同细菌种类所使用的特定培养基可能有所不同。
抗生素敏感性是指细菌对抗生素的敏感程度，可通过肉汤稀释法或Epsilometer试验（也称为E试验）进行测定。
在肉汤稀释法中，将标准化数量的细菌接种到含有系列抗生素稀释液的培养基中。若细菌对该抗生素敏感，则在较高抗生素浓度下无法生长，但在较低浓度下仍可继续增殖，导致培养基变浑浊。细菌无法存活或增殖的最低抗生素浓度被称为该抗生素对特定细菌的最低抑菌浓度，即 MIC 值。
在E试验中，将一条含有预设抗生素浓度梯度的塑料条置于刚涂布有细菌的Mueller-Hinton琼脂（MH-A）培养皿表面。抗生素从试条中扩散至琼脂培养基内，并被细菌吸收。若细菌对该抗生素敏感，则无法增殖并发生死亡，在E试条周围形成清晰的抑菌区域，称为抑菌圈。当抑菌圈边缘与E试条相交处所对应的刻度值，即为该抗生素的最低抑菌浓度（MIC）值。
通常联合使用抗生素以防止细菌产生耐药性菌株。这种联合用药常产生协同作用，而非简单的相加效应。协同作用是指两种抗生素联合使用的效果大于各自单独使用效果的总和。然而，只有当联合用药的最低抑菌浓度（MIC）值比单独使用时至少降低两倍，该效应才被认为具有显著意义。这一标准通过计算部分抑菌浓度（FIC）指数来评估。将每种抗生素在联合用药时的MIC与其单独使用时的MIC之比相加，若所得FIC指数小于0.5，则表明存在协同作用。
抗生素协同作用可通过两种基于E-test的方法进行测定：非交叉试验或交叉试验。在非交叉试验中，首先将两种不同抗生素（具有预设的MIC值）的E条分别贴于两个独立的平板上。待抗生素在培养基中扩散后，移去原始E条，并将另一种抗生素的E条放置于原位置，使其MIC刻度与先前E条的MIC刻度完全重合。交叉试验是非交叉试验的快速版本，将两种抗生素的E条以十字交叉方式同时放置，使它们的MIC刻度在交叉点处相互成90度角。两种方法经孵育后，分别读取每种抗生素在与另一种抗生素联用时的MIC值，读数位置为抑菌圈边缘与E条边缘相交处。随后计算FIC指数。
本视频将演示如何利用E-test和微量肉汤稀释法测定特定抗生素对某种细菌的最小抑菌浓度（MIC）值。您还将学习如何通过交叉试验和非交叉试验来确定两种抗生素之间的协同作用。
首先，穿戴适当的个人防护装备，包括实验手套和实验服。接着，使用70%乙醇对工作区域进行消毒。然后，收集15毫升无菌的含50%裂解马血和20毫克/毫升β-烟酰胺的Mueller-Hinton肉汤，以及五到八个Mueller-Hinton琼脂平板。现在，准备0.5麦氏浊度标准液：量取9.95毫升1%硫酸溶液，然后向其中加入50微升1%氯化钡溶液。充分涡旋混匀，形成浑浊悬液。用铝箔覆盖试管并暂时放置备用。接下来，向一个15毫升试管中加入1毫升生理盐水溶液。
使用无菌接种环从细菌测试平板上刮取细菌生长物样本（此处为G群链球菌），然后将带有细菌的接种环放入生理盐水中，轻轻