Fuente: Anna Bl'ckberg1, Rolf Lood1
1 Departamento de Ciencias Clínicas Lund, División de Medicina de Infecciones, Centro Biomédico, Universidad de Lund, 221 00 Lund Suecia

El conocimiento de las interacciones entre antibióticos y bacterias es importante para entender cómo los microbios evolucionan la resistencia a los antibióticos. En 1928, Alexander Fleming descubrió la penicilina, un antibiótico que ejerce su función antibacteriana interfiriendo con la regeneración de la pared celular (1). Otros antibióticos con diversos mecanismos de acción han sido descubiertos posteriormente, incluyendo medicamentos que inhiben la replicación del ADN y la traducción de proteínas en bacterias; sin embargo, no se han desarrollado nuevos antibióticos en los últimos años. La resistencia a los antibióticos actuales ha ido en aumento, lo que ha dado lugar a enfermedades infecciosas graves que no pueden tratarse eficazmente (2). Aquí, describimos varios métodos para evaluar la resistencia a los antibióticos en poblaciones bacterianas. Cada uno de estos métodos funciona, independientemente del mecanismo de acción de los antibióticos utilizados, porque la muerte bacteriana es el resultado medido. La resistencia a los antibióticos no sólo se disemina rápidamente específicamente a través de los entornos hospitalarios, sino también en toda la sociedad. Con el fin de investigar estos medios de resistencia, se han desarrollado diferentes métodos, incluyendo la prueba del epsilometro (prueba E) y la prueba de dilución del caldo (3).

La prueba E es un método bien establecido y es una herramienta rentable que cuantifica los datos de la concentración mínima de inhibidores (MIC), la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo. Dependiendo de la cepa bacteriana y de los antibióticos utilizados, el valor de la MIC puede variar entre sub g/ml y >1000 g/ml (4). La prueba E se realiza utilizando una tira de plástico que contiene un degradado antibiótico predefinido, que se imprime con la escala de lectura MIC en g/ml. Esta tira se transfiere directamente en la matriz de agar cuando se aplica a la placa de agar inoculada. Después de la incubación, una zona de inhibición elíptica simétrica es visible a lo largo de la tira a medida que se evita el crecimiento bacteriano. MIC se define por el área de inhibición, que es el punto final donde la elipse interseca la tira. Otro método común para determinar el MIC es el método de dilución de microcalina. La dilución de microcalina incorpora diferentes concentraciones del agente antimicrobiano añadido a un medio de caldo que contiene bacterias inoculadas. Después de la incubación, MIC se define como la concentración más baja de antibióticos que impide el crecimiento visible (5). También es un método cuantitativo y se puede aplicar a varias bacterias. Las desventajas de este método incluyen la posibilidad de errores al preparar las concentraciones de los reactivos y el gran número de reactivos necesarios para el experimento. La medición de la resistencia a los antibióticos es imprescindible tanto desde una perspectiva clínica como de investigación, y estos métodos in vitro para investigar la resistencia se discuten y se muestran a continuación.

El perfil de resistencia de una bacteria específica se puede aplicar con el fin de optimizar el tratamiento antibiótico para determinar si un paciente se beneficiaría del tratamiento combinado frente a la terapia única. Para el uso de más de un antibiótico a la vez, es imperativo conocer sus interacciones entre sí y si tienen un efecto aditivo, sinérgico o antagónico. Un efecto aditivo se puede ver cuando el efecto articular de los antibióticos es igual a la potencia de los antibióticos individuales dados a una dosis igual. La sinergia entre los antibióticos, por otro lado, está presente cuando el efecto articular de los antibióticos es más potente que si el medicamento se administrara solo (6). La aplicación de combinaciones de tratamiento antimicrobiano se utiliza para evitar la aparición de resistencia a los antimicrobianos, por lo tanto, para mejorar el efecto del tratamiento antibiótico individual (7). El conocimiento del antagonismo también es tan importante para prevenir el uso innecesario de combinaciones antimicrobianas. La metodología de prueba electrónico ofrece formas sencillas y varias de determinar posibles sinergias y antagonismo entre diferentes agentes antimicrobianos. Con el fin de hacer frente a la proliferación de patógenos resistentes a los antibióticos, el conocimiento de los posibles mecanismos sinérgicos y antagónicos de ciertos antibióticos es importante dando lugar a la eficacia clínica y luchando contra la resistencia multifármaco.

La determinación de la sinergia mediante pruebas E puede dividirse en dos enfoques generales: pruebas cruzadas y no cruzadas. Si bien ambas pruebas de sinergia se basan en el conocimiento previo de los valores individuales del MIC, los dos enfoques son ligeramente diferentes en metodología y enfoque conceptual. En una prueba de sinergia no cruzada, el primer antibiótico en el par a probar se coloca en una placa de agar inoculada con bacterias. Después de permitir que los antibióticos de la primera tira infundan la placa (por ejemplo, después de 1 hora), se retira la tira y se coloca una nueva tira que contiene el segundo antibiótico en el mismo lugar que la primera, asegurándose de colocar los dos valores individuales de MIC encima de cada ot Su. La zona de inhibición resultante se puede analizar como se describió anteriormente, y la sinergia calculada sobre la base de la Ecuación 1.

Ecuación 1 - Concentraciones inhibidoras fraccionarias (FIC)

Valores >0.5 muestra sinergia.

Al recompensar al examinador con placas fáciles de analizar, el método es algo laborioso y lento debido al cambio de tiras, así como la necesidad de usar dos placas por experimento. En su lugar, a menudo se emplea una prueba cruzada. En lugar de añadir las dos tiras de prueba E diferentes posteriormente una encima de la otra (después de la eliminación de la primera), ambas se colocan simultáneamente pero en forma de una cruz (ángulode 90o), con los dos valores MIC previamente determinados formando el ángulo de 90o. Con este enfoque sólo se necesita una placa por prueba de sinergia, así como menos trabajo, por lo que es una opción preferida a pesar de ser un poco más difícil de analizar. Los nuevos valores MIC en el enfoque combinado de antibióticos se pueden visualizar como las zonas de inhibición modificadas, después de lo cual la sinergia puede ser determinada por la Ecuación 1.

En lugar de utilizar un enfoque de placa de agar, un enfoque de microcaldo a menudo puede ser preferencial debido a su mayor flexibilidad (por ejemplo, la capacidad de elegir concentraciones específicas de antibióticos fuera de los límites de una tira de prueba E). Además, se sugiere que las pruebas de microcaldeo son más sensibles debido a su distribución uniforme de antibióticos en una solución líquida, no dependiendo de la disociación dentro de una fase sólida (placa de agar). Los pozos en una microplaca de 96 pocillos serán inoculados con un número determinado de bacterias (106 cfu/ml: la concentración bacteriana se puede estimar mediante mediciones OD600 nm, estándares de turbidez o por muestras de chapado de propagación de diluciones seriales bacterianas 10x), y antibióticos en diferentes diluciones se añadirán a los pozos. Del mismo modo, a las tiras de prueba E MIC se determina como la intersección (pozo/ punto) con la concentración más baja de antibióticos que inhiben el crecimiento visible de bacterias.

Objetivo experimental

  • El siguiente proyecto describe estrategias para determinar los valores MIC de la penicilina G y la gentamicina del grupo G de Streptococcus mediante dos métodos diferentes, la prueba electrónica y la microdilución. Para la prueba E, las placas de agar Mueller-Hinton inoculadas con Streptococcus grupo G se utilizaron en combinación con tiras de gradiente de penicilina G y/o gentamicina; mientras que el caldo MH con 50% de sangre de caballo lysed y 20 mg/ml-NAD se utilizaron con antibióticos solubles junto con Streptococcus grupo G en un enfoque de microcaldo.

Materiales

  • Colonias bacterianas en una placa de agar en sangre, almacenadas <7 días en 4oC
  • Placas de agar de sangre
  • 0.5 Estándar McFarland
    • 1% BacI2
    • 1% H2SO4
  • Tubo salino (2 mL)
  • Aplicador con punta de algodón
  • Placas de agar Mueller-Hinton (placas MHA)
  • Caldo MH con 50% de sangre de caballo lysed y 20 mg/mL-NAD (MH-F)
  • E-test penicilina/gentamicina (o antibióticos de interés) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia, Suecia)
  • Antibióticos penicilina/gentamicina (o antibióticos de interés (polvo/solución))

Nota: Los medios específicos utilizados para el crecimiento bacteriano pueden variar para diferentes especies.

La susceptibilidad a los antibióticos se define como la sensibilidad de una bacteria a los antibióticos y se puede medir mediante una prueba de dilución de caldo o una prueba de epsilometría, también llamada prueba E.

En el método de dilución en caldo, se agrega un número estandarizado de bacterias a un medio de crecimiento que contiene diluciones de antibióticos en serie. Si son susceptibles, las bacterias no pueden crecer a las concentraciones más altas de antibióticos, pero continúan multiplicándose a las concentraciones más bajas de antibióticos, lo que hace que los medios se vuelvan turbios. La concentración mínima de antibiótico en la que las bacterias ya no pueden sobrevivir o multiplicarse se denomina valor de concentración inhibitoria mínima, o MIC, del antibiótico para la bacteria en cuestión.

En una prueba E, se aplica una tira de plástico impregnada con un gradiente predefinido de antibiótico sobre un césped recién extendido de bacterias en una placa de Petri de agar Mueller-Hinton, o MH-A. El antibiótico se difunde en el medio de agar, donde es absorbido por las bacterias. Si son susceptibles, las bacterias no pueden multiplicarse y morirán, formando una zona clara alr