Bron: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood^1
1 Afdeling Klinische Wetenschappen Lund, Afdeling Infectieziekten, Biomedisch Centrum, Lund University, 221 00 Lund Zweden

Kennis van de interacties tussen antibiotica en bacteriën is belangrijk om te begrijpen hoe microben antibioticaresistentie ontwikkelen. In 1928 ontdekte Alexander Fleming penicilline, een antibioticum dat zijn antibacteriële functie uitoefent door interferentie met celwandregeneratie (1). Andere antibiotica met verschillende werkingsmechanismen zijn vervolgens ontdekt, inclusief geneesmiddelen die DNA-replicatie en eiwittranslatie in bacteriën remmen; er zijn echter geen nieuwe antibiotica ontwikkeld in recente jaren. De resistentie tegen huidige antibiotica is toegenomen, wat leidt tot ernstige infectieziekten die niet effectief behandeld kunnen worden (2). Hier beschrijven we verschillende methoden om antibioticaresistentie in bacteriepopulaties te beoordelen. Elk van deze methoden werkt, ongeacht het werkingsmechanisme van de gebruikte antibiotica, omdat bacteriële dood het gemeten resultaat is. Antibioticaresistentie wordt niet alleen snel verspreid in specifiek ziekenhuisomgevingen, maar ook in de hele samenleving. Om dergelijke manieren van resistentie te onderzoeken, zijn verschillende methoden ontwikkeld, waaronder de Epsilometer-test (E-test) en de bouillonverdunningstest (3).

De E-test is een goed gevestigde methode en is een kosteneffectief hulpmiddel dat Minimale Remmende Concentratie (MIC) gegevens kwantificeert, de laagste concentratie van een antimicrobieel dat zichtbare groei van een micro-organisme remt. Afhankelijk van de bacteriestam en gebruikte antibiotica kan de MIC-waarde variëren tussen sub μg/mL tot >1000 μg/mL (4). De E-test wordt uitgevoerd met behulp van een plastic strip met een vooraf gedefinieerde antibioticagradiënt, die is bedrukt met de MIC-leesschaal in μg/mL. Deze strip wordt direct overgebracht op de agarmatrix wanneer toegepast op de geïncubeerde agarplaat. Na incubatie is een symmetrische elliptische remmingszone zichtbaar langs de strip, omdat bacteriegroei wordt voorkomen. MIC wordt gedefinieerd door het remmingsgebied, dat is het eindpunt waar de ellips de strip kruist. Een andere veelgebruikte methode om MIC te bepalen is de microbroth verdunningsmethode. Microbroth verdunning bevat verschillende concentraties van het antimicrobiële middel toegevoegd aan een bouillonmedium met geïncubeerde bacteriën. Na incubatie wordt MIC gedefinieerd als de laagste concentratie van antibioticum die zichtbare groei voorkomt (5). Het is ook een kwantitatieve methode en kan op verschillende bacteriën worden toegepast. Nadelen van deze methode zijn de mogelijkheid van fouten bij het bereiden van de concentraties van de reagentia en het grote aantal reagentia dat voor het experiment vereist is. Het meten van antibioticaresistentie is zowel vanuit klinisch als onderzoeksperspectief cruciaal, en deze in vitro methoden om resistentie te onderzoeken worden hieronder besproken en gepresenteerd.

Het resistieprofiel voor een specifiek bacterie kan worden toegepast om antibioticabehandeling te optimaliseren om te bepalen of een patiënt zou profiteren van combinatiebehandeling versus enkele therapie. Voor het gebruik van meer dan één antibioticum op een enkele tijd is het van essentieel belang om hun interacties met elkaar te kennen en of ze een additief, synergistisch of antagonistisch effect hebben. Een additief effect kan worden gezien wanneer het gezamenlijke effect van de antibiotica gelijk is aan de potentie van de individuele antibiotica gegeven in een gelijke dosis. Synergie tussen antibiotica is daarentegen aanwezig wanneer het gezamenlijke effect van de antibiotica krachtiger is dan wanneer het medicijn alleen zou worden gegeven (6). Het toepassen van combinaties van antimicrobiële behandeling wordt gebruikt om de voorkoming van antimicrobiële resistentie te voorkomen en zo het effect van de individuele antibioticabehandeling te verbeteren (7). Kennis van antagonisme is ook net zo belangrijk om onnodig gebruik van antimicrobiële combinaties te voorkomen. E-test methodologie biedt eenvoudige en verschillende manieren om mogelijke synergie en antagonisme tussen verschillende antimicrobiële middelen te bepalen. Om de proliferatie van antibioticaresistente pathogenen tegen te gaan, is kennis van mogelijke synergistische en antagonistische mechanismen van bepaalde antibiotica belangrijk, resulterend in klinische effectiviteit en het bestrijden van multidrug-resistentie.

De bepaling van synergie met behulp van E-tests kan worden verdeeld in twee brede benaderingen: kruis- en niet-kruistesten. Hoewel beide synergietesten berusten op de eerdere kennis van individuele MIC-waarden, verschillen de twee benaderingen enigszins in methodologie en conceptuele benadering. Bij een niet-kruissynergietest wordt het eerste antibioticum in het te testen paar op een met bacteriën geïncubeerde agarplaat geplaatst. Na het laten infuseren van de antibiotica van de eerste strip in de plaat (bijv. na 1 uur), wordt de strip verwijderd en wordt een nieuwe strip met het tweede antibioticum op dezelfde plaats als de eerste geplaatst, ervoor zorgen dat de twee individuele MIC-waarden boven elkaar worden geplaatst. De resulterende remmingszone kan vervolgens worden geanalyseerd zoals hierboven beschreven, en synergie kan worden berekend op basis van vergelijking 1.

Vergelijking 1 - Fractionele Remmende Concentraties (FIC)

Waarden >0,5 toont synergie.

Hoewel de onderzoeker wordt beloond met gemakkelijk te analyseren platen, is de methode enigszins arbeidsintensief en tijdrovend vanwege het wisselen van strips, evenals de noodzaak om twee platen per experiment te gebruiken. In plaats daarvan wordt vaak een kruistest toegepast. In plaats van de twee verschillende E-test strips achter elkaar boven elkaar toe te voegen (na verwijdering van de eerste), worden ze beide gelijktijdig geplaatst, maar in