Źródło: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood^1
1 Wydział Nauk Klinicznych Lund, Wydział Medycyny Zakaźnej, Centrum Biomedyczne, Uniwersytet w Lund, 221 00 Lund Szwecja

Wiedza na temat interakcji między antybiotykami a bakteriami jest ważna dla zrozumienia, w jaki sposób drobnoustroje ewoluują oporność na antybiotyki. W 1928 roku Alexander Fleming odkrył penicylinę, antybiotyk, który działa przeciwbakteryjnie poprzez zakłócanie regeneracji ściany komórkowej (1). Następnie odkryto inne antybiotyki o różnych mechanizmach działania, w tym leki hamujące replikację DNA i translację białek u bakterii; Jednak w ostatnich latach nie opracowano żadnych nowych antybiotyków. Oporność na obecne antybiotyki wzrasta, co prowadzi do poważnych chorób zakaźnych, których nie można skutecznie leczyć (2). W tym miejscu opisujemy kilka metod oceny oporności na antybiotyki w populacjach bakterii. Każda z tych metod działa, niezależnie od mechanizmu działania stosowanych antybiotyków, ponieważ miarą jest śmierć bakterii. Oporność na antybiotyki rozprzestrzenia się nie tylko szybko w szpitalach, ale także w całym społeczeństwie. W celu zbadania takich sposobów odporności opracowano różne metody, w tym test epsilometryczny (test E) i test rozcieńczenia bulionu (3).

Test elektroniczny jest dobrze ugruntowaną metodą i jest opłacalnym narzędziem, które określa ilościowo dane dotyczące minimalnego stężenia hamującego (MIC), najniższego stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego, które hamuje widoczny wzrost drobnoustroju. W zależności od szczepu bakteryjnego i zastosowanych antybiotyków wartość MIC może wahać się od sub μg/ml do >1000 μg/ml (4). Test elektroniczny jest wykonywany przy użyciu plastikowego paska zawierającego predefiniowany gradient antybiotyku, na którym nadrukowana jest skala odczytu MIC w μg/ml. Pasek ten jest bezpośrednio przenoszony na matrycę agaru po nałożeniu na zaszczepioną płytkę agarową. Po inkubacji wzdłuż pasa widoczna jest symetryczna eliptyczna strefa hamowania, która zapobiega rozwojowi bakterii. MIC jest definiowany przez obszar zahamowania, który jest punktem końcowym, w którym elipsa przecina pas. Inną powszechną metodą określania wartości MIC jest metoda rozcieńczania mikrobulionu. Rozcieńczenie mikrobulionu obejmuje różne stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego dodanego do pożywki bulionowej zawierającej zaszczepione bakterie. Po inkubacji MIC definiuje się jako najniższe stężenie antybiotyku, które zapobiega widocznemu wzrostowi (5). Jest to również metoda ilościowa i może być stosowana do kilku bakterii. Do wad tej metody należy możliwość wystąpienia błędów przy przygotowywaniu stężeń odczynników oraz duża liczba odczynników wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu. Pomiar oporności na antybiotyki jest niezbędny zarówno z perspektywy klinicznej, jak i badawczej, a te metody badania oporności in vitro zostały omówione i zaprezentowane poniżej.

Profil oporności na określoną bakterię można zastosować w celu optymalizacji leczenia antybiotykami w celu określenia, czy pacjent odniesie korzyści z leczenia skojarzonego w porównaniu z pojedynczą terapią. W przypadku stosowania więcej niż jednego antybiotyku jednocześnie konieczne jest poznanie ich wzajemnych interakcji oraz tego, czy mają działanie dodatkowe, synergistyczne czy antagonistyczne. Efekt addytywny można zaobserwować, gdy łączne działanie antybiotyków jest równe sile działania poszczególnych antybiotyków podawanych w jednakowej dawce. Z drugiej strony synergia między antybiotykami występuje wtedy, gdy łączne działanie antybiotyków jest silniejsze niż w przypadku, gdyby lek był podawany samodzielnie (6). Stosowanie kombinacji leczenia przeciwbakteryjnego stosuje się w celu uniknięcia wystąpienia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, a tym samym w celu wzmocnienia efektu indywidualnego leczenia antybiotykami (7). Wiedza na temat antagonizmu jest również równie ważna, aby zapobiec niepotrzebnemu stosowaniu kombinacji środków przeciwdrobnoustrojowych. Metodologia e-testów oferuje proste i kilka sposobów określenia możliwej synergii i antagonizmu między różnymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Aby stawić czoła rozprzestrzenianiu się patogenów opornych na antybiotyki, ważna jest wiedza na temat możliwych synergicznych i antagonistycznych mechanizmów niektórych antybiotyków, co skutkuje skutecznością kliniczną i walką z opornością wielolekową.

Określenie synergii za pomocą testów elektronicznych można podzielić na dwa szerokie podejścia: testy krzyżowe i niekrzyżowe. Podczas gdy oba testy synergii opierają się na wcześniejszej wiedzy na temat poszczególnych wartości MIC, oba podejścia różnią się nieco pod względem metodologii i podejścia koncepcyjnego. W teście synergii krzyżowej pierwszy antybiotyk z badanej pary umieszcza się na płytce agarowej zaszczepionej bakteriami. Po umożliwieniu, aby antybiotyki z pierwszego paska wprowadziły się do płytki (np. po 1 godzinie), pasek jest usuwany, a nowy pasek zawierający drugi antybiotyk umieszcza się dokładnie w tym samym miejscu co pierwszy, upewniając się, że dwie indywidualne wartości MIC są umieszczone jedna na drugiej. Powstałą strefę inhibicji można następnie przeanalizować w sposób opisany powyżej, a synergię obliczyć na podstawie równania 1.

Równanie 1 - Frakcjowe stężenia hamujące (FIC)

Wartości >0,5 wskazują na synergię.

Nagradzając egzaminatora łatwymi do analizy płytkami, metoda ta jest nieco pracochłonna i czasochłonna ze względu na zmianę pasków, a także konieczność użycia dwóch płytek w jednym eksperymencie. Zamiast tego często stosuje się test krzyżowy. Zamiast dodawać dwa różne paski testowe E następnie jeden na drugim (po usunięciu pierwszego), oba są umieszczane jednocześnie, ale w formie krzyża (kąt 90°), przy czym dwie wcześniej określone wartości MIC tworzą kąt 90°. Dzięki takiemu podejściu na test synergii potrzebna jest tylko jedna płytka, a także mniej pracy, co czyni ją preferowanym wyborem, mimo że jest nieco trudniejsza do analizy. Nowe wartości MIC w podejściu skojarzonym z antybiotykami można zwizualizować jako zmodyfikowane strefy hamowania, po których synergię można określić za pomocą równania 1.

Zamiast stosowania podejścia opartego na płytkach agarowych, podejście oparte na mikrobulionie może być często preferowane ze względu na jego większą elastyczność (np. możliwość wyboru określonych stężeń antybiotyków poza limitami paska testowego E). Ponadto sugeruje się, że testy mikrobulionowe są bardziej czułe ze względu na równomierne rozprowadzenie antybiotyków w płynnym roztworze, niezależnej od dysocjacji w fazie stałej (płytka agarowa). Studzienki w 96-dołkowej mikropłytce zostaną zaszczepione określoną liczbą bakterii (10⁶ jtk/ml: stężenie bakterii można oszacować za pomocą pomiarów OD600 nm, norm zmętnienia lub przez rozprowadzenie próbek posiewu z 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń bakteryjnych), a do studzienek zostaną dodane antybiotyki w różnych rozcieńczeniach. Podobnie jak w przypadku pasków testowych E, MIC określa się jako punkt przecięcia (studnia/plamka) o najniższym stężeniu antybiotyków hamujących widoczny rozwój bakterii.

Cel eksperymentalny

• Poniższy projekt opisuje strategie oznaczania wartości MIC penicyliny G i gentamycyny Streptococcus grupy G za pomocą dwóch różnych metod, testu E i rozcieńczenia mikrobulionu. W teście E użyto płytek agarowych Muellera-Hintona zaszczepionych Streptococcus grupy G w połączeniu z paskami gradientowymi penicyliny G i/lub gentamycyny; podczas gdy bulion MH z 50% lizowaną krwią końską i 20 mg/ml β-NAD stosowano z rozpuszczalnymi antybiotykami razem z Streptococcus grupy G w podejściu mikrobulionowym.

Materiały

• Kolonie bakteryjne na płytce z agarem z krwią, przechowywane <7 dni w temperaturze 4°C
• Płytki z agarem z krwią
• 0.5 Standardowy McFarland
  • 1% BaCl₂
  • 1% H₂SO₄
• Rurka z solą fizjologiczną (2 ml)
• Aplikator z bawełnianą końcówką
• Płytki agarowe Muellera-Hintona (płytki MHA)
• Rosół MH z 50% lizowaną krwią końską i 20 mg/ml β-NAD (MH-F)
• E-test penicylina/gentamycyna (lub antybiotyki będące przedmiotem zainteresowania) (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francja, Szwecja)
• Antybiotyki penicylina/gentamycyna (lub antybiotyki będące przedmiotem zainteresowania (proszek/roztwór))

Uwaga: Konkretne podłoża używane do rozwoju bakterii mogą się różnić w zależności od gatunku.