Источник: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood^1
1 Отделение клинических наук Лунда, Отделение инфекционной медицины, Биомедицинский центр, Лундский университет, 221 00 Лунд, Швеция

Знание взаимодействий между антибиотиками и бактериями важно для понимания того, как микробы развивают устойчивость к антибиотикам. В 1928 году Александр Флеминг открыл пенициллин – антибиотик, который оказывает антибактериальную функцию, препятствуя регенерации клеточной стенки (1). Впоследствии были открыты другие антибиотики с различными механизмами действия, в том числе препараты, которые ингибируют репликацию ДНК и трансляцию белка у бактерий; Тем не менее, в последние годы не было разработано никаких новых антибиотиков. Устойчивость к современным антибиотикам растет, что приводит к тяжелым инфекционным заболеваниям, которые не поддаются эффективному лечению (2). В этой статье мы описываем несколько методов оценки устойчивости к антибиотикам в бактериальных популяциях. Каждый из этих методов работает, независимо от механизма действия используемых антибиотиков, потому что бактериальная смерть является измеряемым результатом. Устойчивость к антибиотикам быстро распространяется не только в больницах, но и в обществе. Для исследования таких средств устойчивости были разработаны различные методы, в том числе тест Эпсилометра (E-тест) и тест на разбавление бульона (3).

Е-тест - это хорошо зарекомендовавший себя метод и экономически эффективный инструмент, который количественно оценивает данные минимальной ингибирующей концентрации (MIC), самой низкой концентрации противомикробного препарата, которая подавляет видимый рост микроорганизма. В зависимости от штамма бактерий и используемых антибиотиков значение MIC может варьироваться от суб мкг/мл до >1000 мкг/мл (4). Е-тест проводится с помощью пластиковой полоски, содержащей заданный градиент антибиотика, на который впечатляется шкала показаний MIC в мкг/мл. Эта полоска непосредственно переносится на агаровую матрицу при нанесении на инокулированную агаровую пластину. После инкубации вдоль полосы видна симметричная эллиптическая зона ингибирования, так как рост бактерий предотвращается. MIC определяется областью торможения, которая является конечной точкой, где эллипс пересекает полоску. Еще одним распространенным методом определения МПК является метод разбавления микробульона. Разбавление микробульона включает в себя различные концентрации противомикробного агента, добавляемого в среду бульона, содержащую инокулированные бактерии. После инкубации МПК определяется как самая низкая концентрация антибиотика, которая предотвращает видимый рост (5). Он также является количественным методом и может быть применен к нескольким бактериям. К недостаткам данного метода можно отнести возможность погрешностей при приготовлении концентраций реагентов и большое количество реагентов, необходимых для проведения эксперимента. Измерение устойчивости к антибиотикам является обязательным как с клинической, так и с исследовательской точки зрения, и эти методы исследования резистентности in vitro обсуждаются и демонстрируются ниже.

Профиль резистентности к конкретной бактерии может быть применен для оптимизации лечения антибиотиками, чтобы определить, принесет ли пациенту пользу комбинированное лечение по сравнению с монотерапией. Для одновременного использования более чем одного антибиотика крайне важно знать их взаимодействие друг с другом и иметь ли они аддитивный, синергетический или антагонистический эффект. Аддитивный эффект можно наблюдать, когда совместный эффект антибиотиков равен эффективности отдельных антибиотиков, принимаемых в равной дозе. Синергия между антибиотиками, с другой стороны, присутствует, когда совместный эффект антибиотиков более мощный, чем если бы препарат назначался отдельно (6). Применение комбинаций антимикробной терапии используется для предотвращения возникновения устойчивости к противомикробным препаратам, таким образом, для усиления эффекта индивидуального лечения антибиотиками (7). Знание антагонизма также важно для предотвращения ненужного использования комбинаций противомикробных препаратов. Методология электронного тестирования предлагает простые и несколько способов определения возможного синергизма и антагонизма между различными противомикробными препаратами. Для того, чтобы противостоять распространению устойчивых к антибиотикам патогенов, важно знать о возможных синергических и антагонистических механизмах некоторых антибиотиков, что приводит к клинической эффективности и борьбе с множественной лекарственной устойчивостью.

Определение синергии с помощью E-тестов можно разделить на два широких подхода: перекрестное и неперекрестное тестирование. Несмотря на то, что оба теста на синергию основаны на предыдущих знаниях об отдельных значениях MIC, эти два подхода немного различаются по методологии и концептуальному подходу. В тесте без перекрестного синергетического эффекта первый антибиотик в тестируемой паре помещается на агаровую пластину, инокулированную бактериями. После того, как антибиотики из первой полоски проникнут в планшет (например, через 1 час), полоску удаляют, и новую полоску, содержащую второй антибиотик, помещают точно на то же место, что и первая, убедившись, что два отдельных значения MIC расположены друг над другом. Полученная зона торможения может быть затем проанализирована, как описано выше, и рассчитана синергия на основе уравнения 1.

Уравнение 1 - Фракционные ингибирующие концентрации (FIC)

Values >0.5 демонстрирует синергию.

Хотя экзаменатор награждается легко анализируемыми пластинами, этот метод является несколько трудоемким и трудоемким из-за смены полосок, а также необходимости использования двух пластин в эксперименте. Вместо этого часто используется перекрестный тест. Вместо того, чтобы впоследствии накладывать две разные полоски E-теста друг на друга (после удаления первой), обе располагаются одновременно, но в виде креста ( угол 90°), причем два ранее определенных значения MIC образуют угол 90°. При таком подходе для одного теста на синергию требуется только одна пластина, а также меньше работы, что делает его предпочтительным выбором, несмотря на то, что его немного сложнее анализировать. Новые значения МПК в подходе с комбинированными антибиотиками могут быть визуализированы в виде модифицированных зон ингибирования, после чего синергия может быть определена с помощью уравнения 1.

Вместо использования подхода с агаровой пластиной, подход с микробульоном часто может быть предпочтительным из-за его более высокой гибкости (например, возможность выбора конкретных концентраций антибиотиков за пределами полоски Е-теста). Кроме того, предполагается, что микробульонные тесты являются более чувствительными за счет равномерного распределения антибиотиков в жидком растворе, не зависящем от диссоциации внутри твердой фазы (агаровой пластины). Лунки в 96-луночном микропланшете будут инокулированы определенным количеством бактерий (10⁶ кое/мл: концентрация бактерий может быть оценена с помощью измерений OD600 нм, стандартов мутности или путем распределения образцов из 10-кратных серийных бактериальных разведений), и в лунки будут добавлены антибиотики в различных разведениях. Аналогично полоскам Е-теста МИК определяется как пересечение (лунка/пятно) с наименьшей концентрацией антибиотиков, подавляющих видимый рост бактерий.

Экспериментальная цель

• В приведенном ниже проекте описаны стратегии определения MIC-значений пенициллина G и гентамицина стрептококка группы G двумя различными методами: Е-тестом и микробульонным разведением. Для Е-теста использовали агаровые пластины Мюллера-Хинтона, инокулированные Streptococcus группы G, в сочетании с градиентными полосками пенициллина G и/или гентамицина; в то время как MH-бульон с 50% лизированной лошадиной крови и 20 мг/мл β-NAD использовали с растворимыми антибиотиками вместе со стрептококком группы G в микробульонном подходе.

Материалы

• Колонии бактерий на кровяном агаровом планшете, хранящемся в течение <7 суток при 4°C
• Кровяные агаровые пластины
• 0,5 стандарта Макфарланда
  • 1% BaCl₂
  • 1% H₂SO₄
• Солевой раствор в трубке (2 мл)
• Аппликатор с ватным наконечником
• Агаровые пластины Мюллера-Хинтона (пластины MHA)
• Бульон MH с 50% лизированной лошадиной кровью и 20 мг/мл β-NAD (MH-F)
• Е-тест пенициллин/гентамицин (или антибиотики, представляющие интерес) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Франция, Швеция)
• Антибиотики пенициллин/гентамицин (или антибиотики, представляющие интерес (порошок/раствор))

Примечание: Конкретные среды, используемые для роста бактерий, могут различаться для разных видов.