Kaynak: Anna Bläckberg¹, Rolf Lood¹
¹ Lund, Enfeksiyon Tıbbı Anabilim Dalı, Biyomedikal Merkezi, Lund Üniversitesi, 221 00 Lund İsveç

Antibiyotikler ve bakteriler arasındaki etkileşimlerin bilinmesi, mikropların antibiyotik direncini nasıl geliştirdiğini anlamada önemlidir. 1928'de Alexander Fleming, hücre duvarı yenilenmesine müdahale ederek antibakteriyel işlevini yerine getiren bir antibiyotik olan penisilini keşfetti (1). Bakterilerde DNA replikasyonunu ve protein translasyonunu inhibe eden ilaçlar da dahil olmak üzere çeşitli etki mekanizmalarına sahip diğer antibiyotikler daha sonra keşfedilmiştir; Ancak son yıllarda yeni bir antibiyotik geliştirilmemiştir. Mevcut antibiyotiklere direnç artmakta ve bu da etkili bir şekilde tedavi edilemeyen ciddi enfeksiyon hastalıklarına neden olmaktadır (2). Burada, bakteri popülasyonlarında antibiyotik direncini değerlendirmek için çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemlerin her biri, kullanılan antibiyotiklerin etki mekanizmasından bağımsız olarak işe yarar, çünkü bakteri ölümü ölçülen sonuçtur. Antibiyotik direnci sadece özellikle hastane ortamlarında değil, aynı zamanda toplum genelinde de hızla yayılmaktadır. Bu tür direnç araçlarını araştırmak için Epsilometre testi (E-testi) ve et suyu seyreltme testi dahil olmak üzere farklı yöntemler geliştirilmiştir (3).

E-test iyi bilinen bir yöntemdir ve bir mikroorganizmanın görünür büyümesini engelleyen en düşük antimikrobiyal konsantrasyonu olan Minimal İnhibitör Konsantrasyon (MIC) verilerini ölçen uygun maliyetli bir araçtır. Kullanılan bakteri suşuna ve antibiyotiklere bağlı olarak, MİK değeri μg/mL'nin altında >1000 μg/mL arasında değişebilir (4). E-testi, μg/mL cinsinden MIC okuma ölçeği ile basılmış, önceden tanımlanmış bir antibiyotik gradyanı içeren plastik bir şerit kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şerit, aşılanmış agar plakasına uygulandığında doğrudan agar matrisi üzerine aktarılır. İnkübasyondan sonra, bakteri üremesi önlendiği için şerit boyunca simetrik bir eliptik inhibisyon bölgesi görülebilir. MIC, elipsin şeritle kesiştiği son nokta olan inhibisyon alanı ile tanımlanır. MIC'yi belirlemek için başka bir yaygın yöntem, mikrobroth seyreltme yöntemidir. Mikrobrot seyreltmesi, aşılanmış bakteriler içeren bir et suyu ortamına eklenen antimikrobiyal ajanın farklı konsantrasyonlarını içerir. İnkübasyondan sonra MİK, gözle görülür büyümeyi önleyen en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak tanımlanır (5). Aynı zamanda kantitatif bir yöntemdir ve birkaç bakteriye uygulanabilir. Bu yöntemin dezavantajları, reaktiflerin konsantrasyonlarını hazırlarken hata olasılığını ve deney için gerekli olan çok sayıda reaktifi içerir. Antibiyotik direncinin ölçülmesi hem klinik hem de araştırma açısından zorunludur ve direnci araştırmak için bu in vitro yöntemleri aşağıda tartışılmış ve sergilenmiştir.

Belirli bir bakteri için direnç profili, bir hastanın tek tedaviye karşı kombinasyon tedavisinden fayda sağlayıp sağlamayacağını belirlemek için antibiyotik tedavisini optimize etmek için uygulanabilir. Aynı anda birden fazla antibiyotiğin kullanımı için, birbirleriyle etkileşimlerini ve katkı maddesi, sinerjik veya antagonistik bir etkiye sahip olup olmadıklarını bilmek zorunludur. Antibiyotiklerin ortak etkisi, eşit dozda verilen bireysel antibiyotiklerin gücüne eşit olduğunda ilave bir etki görülebilir. Öte yandan, antibiyotikler arasındaki sinerji, antibiyotiklerin ortak etkisinin, ilacın tek başına verileceği duruma göre daha güçlü olduğu durumlarda ortaya çıkar (6). Antimikrobiyal tedavi kombinasyonlarının uygulanması, antimikrobiyal direncin oluşmasını önlemek ve böylece bireysel antibiyotik tedavisinin etkisini arttırmak için kullanılır (7). Antimikrobiyal kombinasyonların gereksiz kullanımını önlemek için antagonizma bilgisi de önemlidir. E-test metodolojisi, farklı antimikrobiyal ajanlar arasındaki olası sinerjiyi ve antagonizmayı belirlemek için basit ve çeşitli yollar sunar. Antibiyotiğe dirençli patojenlerin çoğalmasıyla yüzleşmek için, bazı antibiyotiklerin olası sinerjik ve antagonistik mekanizmalarının bilinmesi, klinik etkinlik ve çoklu ilaç direnciyle mücadele ile sonuçlanan önemlidir.

E-testler kullanılarak sinerjinin belirlenmesi iki geniş yaklaşıma ayrılabilir: çapraz ve çapraz olmayan test. Her iki sinerji testi de bireysel MIC değerlerinin önceki bilgisine dayansa da, iki yaklaşım metodoloji ve kavramsal yaklaşım açısından biraz farklıdır. Çapraz olmayan bir sinerji testinde, test edilecek çiftteki ilk antibiyotik, bakterilerle aşılanmış bir agar plakasına yerleştirilir. İlk şeritten gelen antibiyotiklerin plakayı infüze etmesine izin verdikten sonra (örneğin 1 saat sonra), şerit çıkarılır ve ikinci antibiyotiği içeren yeni bir şerit, birinciyle tam olarak aynı yere yerleştirilir, bu da iki ayrı MIC değerini üst üste yerleştirdiğinizden emin olun. Elde edilen inhibisyon bölgesi daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi analiz edilebilir ve sinerji Denklem 1'e göre hesaplanabilir.

Denklem 1 - Fraksiyonel İnhibitör Konsantrasyonlar (FIC)

>0.5 değerleri sinerjiyi gösterir.

Sınav görevlisini analiz etmesi kolay plakalarla ödüllendirirken, şeritlerin değişmesinin yanı sıra deney başına iki plaka kullanma ihtiyacı nedeniyle yöntem biraz zahmetli ve zaman alıcıdır. Bunun yerine, genellikle bir çapraz test kullanılır. İki farklı E-test şeridini daha sonra üst üste eklemek yerine (birincisi çıkarıldıktan sonra), her ikisi de aynı anda ancak bir çapraz şeklinde ( 90° açı) yerleştirilir ve daha önce belirlenen iki MIC değeri 90° açıyı oluşturur. Bu yaklaşımla, sinerji testi başına yalnızca bir plakaya ve daha az çalışmaya ihtiyaç duyulur, bu da analiz edilmesi biraz daha zor olmasına rağmen tercih edilen bir seçim haline getirir. Kombine antibiyotik yaklaşımındaki yeni MİK değerleri, modifiye edilmiş inhibisyon bölgeleri olarak görselleştirilebilir, daha sonra sinerji Denklem 1 ile belirlenebilir.

Bir agar plakası yaklaşımı kullanmak yerine, daha yüksek esnekliği nedeniyle bir mikrobroth yaklaşımı genellikle tercih edilebilir (örneğin, bir E-test şeridinin sınırları dışında belirli antibiyotik konsantrasyonlarını seçme yeteneği). Ayrıca, mikrobroth testlerinin, antibiyotiklerin katı bir faz (agar plakası) içindeki ayrışmaya bağlı değil, sıvı bir çözelti içinde eşit dağılımı nedeniyle daha hassas olduğu önerilmektedir. 96 oyuklu bir mikroplakadaki kuyucuklar, belirli sayıda bakteri ile aşılanacaktır (10⁶ cfu / mL: bakteri konsantrasyonu, OD600 nm ölçümleri, bulanıklık standartları veya 10x bakteri seri seyreltmesinden yayılmış kaplama numuneleri ile tahmin edilebilir) ve kuyucuklara farklı seyreltmelerde antibiyotikler eklenecektir. Benzer şekilde, E-test şeritlerine benzer şekilde, MIC, bakterilerin görünür büyümesini engelleyen en düşük antibiyotik konsantrasyonuna sahip kesişme noktası (kuyu / nokta) olarak belirlenir.

Deneysel Amaç

Aşağıdaki projede, Streptococcus grubu G'nin penisilin G ve gentamisinin MİK değerlerini E-test ve mikrobrot seyreltme olmak üzere iki farklı yöntemle belirleme stratejileri açıklanmaktadır. E-test için, Streptococcus grubu G ile aşılanmış Mueller-Hinton agar plakaları, penisilin G ve/veya gentamisinin gradyan şeritleri ile kombinasyon halinde kullanıldı; P parçalanmış at kanı içeren MH-suyu ve 20 mg/mL β-NAD ise çözünür antibiyotiklerle birlikte Streptococcus grubu G ile birlikte mikroet suyu yaklaşımında kullanıldı.

Malzemeler

4°C
Kanlı agar plakaları
0.5 McFarland standardı
- 1% BaCl₂
- 1% H₂SO₄
Tuzlu su tüpü (2 mL)
Pamuk uçlu aplikatör
Mueller-Hinton agar plakaları (MHA plakaları)
P parçalanmış at kanı ve 20 mg/mL β-NAD (MH-F)
E-test penisilin/gentamisin (veya ilgilenilen antibiyotikler) (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Fransa, İsveç)
Antibiyotikler penisilin/gentamisin (veya ilgilenilen antibiyotikler (toz/solüsyon))

Not: Bakteri üremesi için kullanılan spesifik ortam, farklı türler için farklılık gösterebilir.

Transcript