Overview
资料来源：安娜·布吕克伯格1， 罗尔夫·卢德1
1临床科学系 隆德，感染医学系，生物医学中心，隆德大学，221 00 隆德瑞典
了解抗生素和细菌之间的相互作用对于了解微生物如何进化抗生素耐药性非常重要。1928年，亚历山大·弗莱明发现了青霉素，一种通过干扰细胞壁再生来发挥抗菌作用的抗生素（1）。随后发现了其他具有不同作用机制的抗生素，包括抑制细菌DNA复制和蛋白质转化的药物;然而，近年来没有开发任何新的抗生素。对现行抗生素的耐药性一直在增加，导致无法有效治疗的严重传染病（2）。在这里，我们描述了几种评估细菌群抗生素耐药性的方法。这些方法中的每一个都有效，无论所使用的抗生素的作用机制如何，因为细菌死亡是测量的结果。抗生素耐药性不仅通过医院环境迅速传播，而且在全社会迅速传播。为了研究这种抗性手段，已经开发出了不同的方法，包括Epsilo计测试（E测试）和肉汤稀释试验（3）。
电子测试是一种公认的方法，是一种具有成本效益的工具，可量化最小抑制浓度 （MIC） 数据，这是抑制微生物可见生长的抗菌素的最低浓度。根据所使用的细菌菌株和抗生素，MIC 值在子 μg/mL 到 >1000 μg/mL （4） 之间可能有所不同。E-test 使用包含预定义的抗生素梯度的塑料条进行，该塑料条以 μg/mL 为单位与 MIC 读数表一起印记。当应用于接种琼脂板时，该条带直接在琼脂基质上传输。孵育后，随着细菌生长的预防，沿带可见对称的椭圆抑制区。MIC 由抑制区域定义，该区域是椭圆与条带相交的端点。另一种确定MIC的常见方法是微溴稀释法。微溴稀释含有不同浓度的抗菌剂添加到含有接种细菌的汤培养基中。孵育后，MIC被定义为阻止可见生长的最低浓度抗生素（5）。它也是一种定量方法，可应用于多种细菌。该方法的缺点包括制备试剂浓度时可能存在错误，以及实验所需的大量试剂。从临床和研究的角度衡量抗生素耐药性是必须的，下面将讨论并展示这些研究耐药性的体外方法。
可以应用特定细菌的耐药性概况，以优化抗生素治疗，以确定患者是否会受益于联合治疗与单一治疗。对于一次使用多个抗生素，必须了解它们之间的相互作用，以及它们是否具有添加剂、协同或对抗作用。当抗生素的关节效应等于以等剂量给予的单个抗生素的效力时，可以看到添加剂效应。另一方面，当抗生素的联合作用比单独给予药物更有效时，抗生素之间的协同作用就存在（6）。应用抗菌治疗组合，避免抗菌素耐药性的发生，从而增强单个抗生素治疗的效果（7）。对抗知识对于防止不必要地使用抗菌素组合也同样重要。电子测试方法提供了简单和多种方法，以确定不同抗菌剂之间可能的协同作用和对抗。为了面对抗生素耐药病原体的扩散，了解某些抗生素的可能协同和对抗机制对于临床疗效和对抗多药耐药性非常重要。
使用电子测试确定协同效应可以分为两大类：交叉测试和非交叉测试。虽然这两种协同测试都依赖于以前对各个 MIC 值的了解，但两种方法在方法和概念方法上略有不同。在非交叉协同测试中，被测试的对中的第一个抗生素被放置在接种细菌的琼脂板上。允许从第一条中注入板中的抗生素（例如，在 1 小时后），去除该条，并将包含第二种抗生素的新条放在与第一个抗生素完全相同的位置，确保将两个单独的 MIC 值放在每个 ot 的顶部她。然后，可以按上述方式分析产生的抑制区，并根据公式 1 计算协同效应。
公式 1 - 分数抑制浓度 （FIC）
值 >0.5 显示了协同效应。
虽然用易于分析的板来奖励考官，但由于条带的变化，以及每个实验需要使用两个板，这种方法有些费力和费时。相反，通常采用交叉测试。而不是添加两个不同的电子测试条随后彼此的顶部（删除第一个后），两者同时放置，但以十字（90°
角）的形式，与两个先前确定的MIC值形成90°角。通过这种方法，每个协同测试只需要一个板，而且工作更少，尽管分析起来稍微困难一些，但还是成为首选。组合抗生素方法中新的MIC值可以可视化为经过修饰的抑制区，之后可以通过公式1确定协同效应。
微broth方法通常具有更高的灵活性（例如，在电子测试条限制之外选择特定浓度的抗生素的能力），而不是使用琼脂板方法，通常可以优先使用。此外，微broth测试建议更敏感，因为它们在液体溶液中均匀分布抗生素，而不是取决于固体相（琼脂板）内的解散。96孔微孔中的孔将接种一组细菌（106 cfu/mL：细菌浓度可通过OD600 nm测量、浊度标准或从10倍细菌系列稀释中传播电镀样品来估计），以及不同稀释液中的抗生素将被添加到井中。同样，对于电子测试条，MIC被确定为与抗生素浓度最低抑制细菌可见生长的交叉点（井/点）。
实验目标
- 以下项目描述了通过两种不同的方法确定青霉素G和链球菌组G的基母菌素的MIC值的策略，即电子测试和微溴稀释。在电子测试中，用G链球菌组接种的Mueller-Hinton琼脂板与青霉素G和/或文母素的梯度条结合使用;而MH-broth与50%溶化马血和20mg/mLβ-NAD一起使用可溶性抗生素与链球菌组G在微broth方法。
材料
- 血琼脂板上的细菌菌落，在4°C中储存<7天
- 血琼脂板
- 0.5 麦克法兰标准
- 1% 巴克莱2
- 1% H2SO4
- 盐管 （2 mL）
- 棉尖施用器
- 穆勒-欣顿琼脂板（MHA板）
- 含有50%裂裂马血和20mg/mL +-NAD（MH-F）的MH肉汤
- 电子测试青霉素/金霉素（或感兴趣的抗生素）（BioMerieux，马西埃托莱，法国，瑞典）
- 抗生素青霉素/青霉素（或感兴趣的抗生素（粉末/溶液））
注意：用于细菌生长的特定介质可能因不同物种而异。
Procedure
1. 爱普国际测度测试（电子测试）
-
设置
- 戴上手套和实验室外套
- 使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒，为工作空间做好准备
- 收集穆勒-欣顿琼脂板（MHA板）
-
准备麦克法兰浊度标准 0.5
- 制备1%的氯化铵溶液（BaCl2）：
在100 mL蒸馏水中加入1克无水氯化物（BaCl2）。漩涡井。 - 制备1%的硫酸溶液（H2SO4）：
在99 mL蒸馏水中加入1 mL的浓缩H2SO4。漩涡井。 - 准备麦克法兰浊度标准 0.5 号：
50 μL BaCl2溶液，5 mL 1% H2SO4溶液。涡旋溶液好，以获得浑浊的悬浮液。 - 将麦克法兰浊度标准 0.5 号保存在铝箔覆盖的管子中。在 25°C 下存放最多 6 个月。涡旋井到同质溶液使用前。
- 制备1%的氯化铵溶液（BaCl2）：
-
准备 MHA 板
- 使用无菌循环从血琼脂板中刮取链球菌组 G 细菌。混合成1mL的盐水，涡旋到暂停的细菌。
- 将悬架与麦克法兰标准0.5进行比较，以获得相同的浊度，以便在实验过程中具有相同的接种尺寸。使用额外的盐水或细菌调节浓度。
- 使用无菌棉倒施用器为 MHA 板接种。轻轻涂抹板以覆盖表面。继续执行下面描述的三种方法之一 （1.4-1.6）。
-
单一抗生素耐药性测试。 链球菌组 G，对青霉素 G 或根霉素的抗药性
- 在 MHA 板的中心放置一个电子测试条（青霉素 G 或金霉素）（图1 A，B）。
- 孵育18-20小时，37°C。
- 阅读结果。MIC 被测量为与分级抗生素测试条相交的抑制区（图 1 C，D）。
图1：单电子测试。将E-测试条A）青霉素G和B）根霉素放在穆勒Hinton琼脂板上，在（A和B）和后（C和D）过夜，覆盖着G链球菌群的细菌菌落在37°C 5% CO2孵育。请点击此处查看此图的较大版本。
-
协同测试交叉方法。链球菌组G，对青霉素G和根霉素的抗药性。
- 将两个带有不同抗生素（如青霉素 G 和根霉素）的 E 测试条置于接种的 MHA 板上，形成交叉形式。
- 为了获得最准确的结果，目标是将十字以大约 90° 角放置在刻度之间的交点处，其 MIC 值以前在单个抗生素耐药性测试中确定（图 2 A）。
- 请注意，一旦条被放置在琼脂板上，它们就不应该移动，因为某些抗生素可能已经被板吸收。因此，将条带保持在稍微错误的角度（例如 85°）和实际 MIC 值高达 1-2 mm 时更为合适。建议在三元运行实验以减少此问题。
- 孵育18-20小时，37°C。
- 阅读结果。MIC 被测量为与每个电子测试条上分级抗生素测试条相交的抑制区（图 2 B）。
- 使用分数抑制浓度 （FIC） （ 方程1） 的公式来确定协同效应。
- 将两个带有不同抗生素（如青霉素 G 和根霉素）的 E 测试条置于接种的 MHA 板上，形成交叉形式。
图2：协同检测 - 交叉测试。青霉素G和文母素MIC在链球菌组（A）和后（B）在37°C 5%CO2孵育过夜的结果。在两个单独的 MIC 值之间形成 90° 角（青霉素 G： 0.094 μg/mL，绅士素：8 μg/mL）。请点击此处查看此图的较大版本。
-
协同测试非交叉方法。链球菌组G，对青霉素G和根霉素的抗药性。
- 将电子测试条置于 MHA 板的中心（图 3 A，D）。
- 标记以前确定的每个条带上的 MIC 值的位置。
- 在室温下孵育1小时。
- 丢弃每个 MHA 板的 E 测试条 （图 3 B，E）。
- 将第二个电子测试条（包含不同的抗生素）分别放在先前移除的带子的面积上，以便其 MIC 值与标记相对应并对齐。
- 孵育18-20小时，37°C。
- 阅读结果。MIC 被测量为与每个电子测试条上分级抗生素测试条相交的抑制区（图 3 C，F）。
- 为了确定协同效应，使用分数抑制浓度 （FIC） 公式 （公式 1）。
图3：协同检测- 非交叉测试。在链球菌组G.A）根他霉素带（8微克/毫升居中）的链球菌组G细菌上，青霉素G和文母素的MIC抗菌协同试验结果，B）去除根霉素带，C）联合根霉素 / 青霉素 G 条 （0.094 μg/mL 居中）在链球菌组 G 细菌的顶部， D）青霉素 G 条 （0.094 μg/mL 居中）， E）去除青霉素 G 条， F）联合青霉素 G /在链球菌群G细菌顶部的根霉菌带（8微克/毫升居中）。请点击此处查看此图的较大版本。
2. 兄弟测试
-
设置
- 戴上手套和实验室外套
- 使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒，为工作空间做好准备
- 收集15mL MH汤与50%裂裂马血和20毫克/mL +-NAD （MH-F）
-
（可选）执行电子测试 [协议 1] 以确定固体介质上的 MIC
- 虽然是可选的，但此类知识将允许更好的实验设计（例如，添加的抗生素的浓度可以设计为围绕从板中确定的 MIC 值），从而增加成功实验的机会。
-
准备细菌接种。如上所述，细菌浓度可以通过 OD nm 测量或麦克法兰浊度标准进行估计
-
OD600 nm 方法
- 获得具有既定细菌浓度的细菌悬浮液
- 稀释 MH-F 肉汤中的培养，以达到 0.003 的 OD600
-
麦克法兰浊度法
- 将 15 mL MH-F 汤放入无菌管中。
- 用细菌（从盘子）接种MH-F肉汤到麦克法兰水平。大力涡旋溶液。将溶液倒入无菌培养皿中。
-
OD600 nm 方法
-
准备抗生素
- 确定所需的抗生素浓度
- 从 E-测试中识别 MIC 值（例如，青霉素 G 为 0.125 μg/mL，而金素为 8 μg/mL）
- 将琼脂板MIC值乘以24-27，对应四-七 2x连续稀释。这将是抗生素的起始浓度。（例如，对于青霉素 G，7 个 2x 串行稀释：0.125 μg/mL x 27 = 16 μg/mL;对于温西霉素，四个 2x 串行稀释 8 μg/mL x 24 = 128 μg/mL
- 乘以所需的起始值100倍，以确定抗生素的库存浓度（例如1.6毫克/毫克青霉素G和12.8毫克/mL甘他素的库存）
- 相应地制备100倍抗生素库存浓度
- 溶解抗生素在10mL灭菌水中，并涡旋产生库存溶液（例如16毫克青霉素G和128毫克gentamicin，以创造上述库存）
- 确定所需的抗生素浓度
-
将细菌添加到微孔
- 在96孔微针板的前3排的井中，含有细菌接种的Aliquote 200μl MH-F肉汤，用于三联实验。
-
在微孔中添加抗生素
- 将含有细菌的额外 MH-F 肉汤添加到第一列井（A1、B1、C1）中，使总体积达到 400 μL。
- 将4μL的抗生素浓度添加到第一列油井中。由于样品含有400μL，它将导致抗生素稀释100倍。
- 通过将 200 μL 细菌/抗生素从 A1 转移到 A2，一直转移到 A11，从而产生 2 倍的连续稀释。在稀释物之间大力移位。对其他行重复此步骤。
- 从 11 柱中取出 200 μL，使所有井中的最终体积为 200 μL。
- 将最后一列（A12、B12、C12）不带抗生素作为对照。
-
确定 MIC 值
- 在 37°C 下孵育 96 孔微小奶嘴板 24 小时，不发抖。
- MIC值被定义为稀释系列中最后一口没有明显细菌生长的井（图4）。但是，只有当原始接种大小正确时，才能信任此值。
图4：由肉汤稀释测定MIC。MIC被定义为在改变浊度之前表现出清晰（细菌没有生长）的最后一口井。行是青霉素 G 的 MIC 值的重复项，行是 gentamicin 的 MIC 值的重复项，与链球菌组 G. A 的隔离物相比，B） 对 A （a） 值的示意图解释灰色 = 无增长;白色 = 增长）。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：稀释序列的原理法法，以计算原细菌浓度。稀释液以所述方式执行（10x 稀释系列在 180 μL 中稀释 20 μL），然后 A-H 行中的 10 μL 被如所示在两个单独的血琼脂板上镀。请点击此处查看此图的较大版本。
-
确定原始接种大小
注：Microbroth 测定法对使用的原始接种尺寸非常敏感。过量的接种量会产生假阳性结果，因为添加的抗生素将无法以该比例抑制生长。因此，验证微井中添加了多少细菌至关重要。虽然数据在实验点不可用（由于需要24小时孵育），但它将作为控制。如果添加的细菌数量在规定的浓度范围内，则 MIC 值是可信的。如果接种过高或过低，则需要重复实验。-
连续稀释细菌
- 准备一个96孔微蒂剂板来稀释原来的细菌浓度，以确定接种大小。最佳体积为 200 μL，含有 105-6种细菌。要执行稀释，首先对 B-H 中每个井（三联体 1-3）中的每个井进行等分 180 μL 无菌 PBS。
- 接下来，将100μl的细菌溶液加入A（三联体1-3）。
- 通过将 20 μl 细菌从 A 转移到 B，大力移液，生成 10 倍连续稀释（以三联苯为单位）。重复 C-H 的步骤。
-
板细菌稀释剂，用于确定接种大小
- 根据图5标记血琼脂板。
- 根据图5将10μL从串行稀释转移到板。
- 在 37°C 下孵育板 20-24 小时。
-
确定细菌接种大小
- 计算5-50个菌落内的点细菌数量（图6）。
- 通过计算三联体样品的平均值，乘以稀释系数（例如，B样品的10倍，C样品的100倍，D样品的1000x等），再乘100，以补偿10μL的斑点体积，从而得出以 cfu/mL 表示的接种量。如果接种量在 105-6 cfu/mL 内，则可以信任 MIC 数据。
-
连续稀释细菌
图 6：确定接种量。根据图5接种的细菌在37°C下孵育20-24小时，然后计数。D行有大量殖民地需要计数（例如 5-50）。A 中的样品未稀释，B 稀释 10x，C 稀释 100x，D 稀释 1000x，每个点仅镀 10 μL。请点击此处查看此图的较大版本。
抗生素易感性被定义为细菌对抗生素的敏感性，可以使用肉汤稀释测试或Epsilo计测试（也称为电子测试）进行测量。
在肉汤稀释法中，在含有连续抗生素稀释的生长介质中加入标准化数量的细菌。如果易感，细菌不能以较高的抗生素浓度生长，但继续以较低的抗生素浓度繁殖，导致介质变浑浊。细菌无法生存或繁殖的最低抗生素浓度称为特定细菌的抗生素最低抑制浓度（即 MIC） 值。
在E测试中，在穆勒-欣顿琼琼琼琼鱼或MH-A，Petri板上，在刚刚传播的细菌草坪上涂上浸渍抗生素预定义梯度的塑料条。抗生素扩散到琼脂培养物中，在那里被细菌所接受。如果易感，细菌不能繁殖，就会死亡，在电子条周围形成一个清晰的区域，称为生长抑制区。在生长与电子条相交的点，刻度上的相应值给出抗生素的MIC值。
通常使用抗生素来防止细菌的抗生素耐药菌株的出现。这通常会导致协同效应，而不是累加效应。协同效应意味着两种抗生素的综合效应大于其个体活动的总和。然而，只有当抗生素组合的MIC值至少降低两倍时，这种效果才被认为是显著的。通过计算分数抑制浓度（或 FIC）指数来评估此标准。通过将每种抗生素的MIC与每种抗生素的MIC分别相和，FIC指数小于0.5表示协同效应。
抗生素协同作用可以使用两种基于电子测试的方法进行测量：非交叉测试或交叉测试。在非交叉测试中，首先，两种具有预定 MIC 值的不同抗生素的 E 条应用于两个单独的板。抗生素扩散到介质后，将去除原来的电子条，并放置备用抗生素的E条，使其MIC刻度完全位于先前带的MIC刻度上。在交叉测试中，这是一个更快的非交叉测试版本，两种抗生素的E条被放置在一个交叉形式，这样他们的MIC标记的尺度在交叉处形成90度角。在两种技术中孵育后，在生长抑制区与电子条的边缘相交时，将读取每种抗生素与其他抗生素结合的MIC值。然后，计算 FIC 索引。
本视频将演示如何使用电子测试和微汤稀释测试确定给定细菌的给定抗生素的 MIC 值。您还将学习如何使用交叉测试和非交叉测试来确定两种抗生素之间的协同作用。
首先，穿上任何适当的个人防护装备，包括实验室手套和实验室外套。接下来，使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。接下来，收集15毫升无菌的穆勒-欣顿肉汤，含有50%的乳化马血和每毫升20毫克β-烟酰胺。和五到八个穆勒-欣顿琼脂板。现在，准备麦克法兰浊度标准号0.5，测量出9.95毫升的1%硫酸溶液。然后，在硫酸溶液中加入50微升1%氯化铵溶液。涡旋溶液良好，获得浑浊悬浮液。用铝箔盖住管子，放在一边。接下来，将一毫升盐水溶液放入15毫升的管子中。
使用无菌循环从细菌测试板中刮取细菌生长的样本，这里，链球菌组 G。然后，将充满细菌的循环放入盐水溶液中，轻轻搅拌，然后涡旋管好。现在，将细菌悬浮液和麦克法兰浊度标准并排放置，并比较其浊度等价性。加入额外的盐水或细菌菌落，直到细菌悬浮液的浊度符合标准。一旦获得所需的浊度，将无菌棉尖施用器浸入细菌悬浮液中。要给 MH-A 板接种，请用锯齿形运动轻轻拭动整个板表面。接下来，在板的底部贴上细菌的名称和日期。
首先，拿出一个青霉素G E测试条，用钳子在边缘握住它。将条带轻轻放入刚擦拭的 MH-A 板的中心，然后更换盖子。在此示例中，还测试了第二种抗生素 gentamicin。因此，带子放置过程重复与第二板和gentamicin E测试条。要确定电子测试的结果，请收集包含青霉素 G E 测试条的第一个板。现在，确定抑制区与抗生素条相交的点。读取刻度上的相应数值。此值表示青霉素 G 的 MIC 值。
首先，用链球菌组G菌株接种MH-A板。在盘子底部贴上细菌名称、使用抗生素和日期的标签。现在，在盘子的中心放置一个电子测试条，用于感兴趣的抗生素。然后，以 90 度角将第二个测试条与第一条条保持至第一条，并找到其 MIC 标记。在两个 MIC 值相交的点上，轻轻地将第二个电子条条放在第一个电子条带上。放置条带后，不要移动它们。接下来，在37摄氏度下孵育板18至20小时。
接种两个MH-A板后，用链球菌组G菌株，在一个板的表面放置一个抗生素的E测试条。然后，如所示，在第二个板上放置另一种抗生素的E测试条。使用塑料接种回路，在各自板的表面标记每种抗生素的MIC值。接下来，覆盖盘子，在室温下孵育一小时。在此之后，使用钳子卸下 E 条。接下来，收集一个板和一个电子测试条，用于另一种抗生素。将电子测试条放在第一条条留下的印记上，并找到 E 条上的 MIC 值与标记的线对齐的点。轻轻地将条带放在这个相交点。对第二个板重复此过程，并在 37 摄氏度下孵育两个板 18 到 20 小时。
首先，获得具有既定细菌浓度的细菌悬浮液，并稀释MHF汤中的培养物，以达到0.003的OD600。接下来，称量16毫克青霉素G和128毫克的绅士青霉素。将每个称量的干抗生素转移到215毫升锥形管中。在每个锥形管中加入10毫升蒸馏水，通过涡旋混合均匀。用抗生素名称和浓度标记管子。
在三联体中执行测定，将400微升的工作细菌溶液加入96孔微蒂剂板三排的第一口井中。接下来，在MHF汤中加入200微升的工作细菌溶液到三排的井中。现在，要产生双倍连续抗生素稀释，首先在第一口井中加入四微升抗生素，产生100倍稀释。依次，将200微升的细菌抗生素溶液输送到每口井，从第一口从第一口从第二口到每行最后一口，每次转液两到三次，确保适当混合。丢弃最后200微升的细菌抗生素溶液。
要确定青霉素G的溴微稀释试验的结果，首先找到没有明显细菌生长的井，表明缺乏浊度。从这些井中，确定抗生素浓度最低的油井。这表示被测细菌的青霉素G的MIC值。根霉质的MIC值可以用相同的测定法和技术来确定。
要确定非交叉测试的结果，请收集包含青霉素 G E 条的第一个板。然后，确定生长抑制区与抗生素条相交的点。刻度上的相应值表示青霉素 G 的 MIC 值与根霉素结合使用。在此示例中，MIC 值组合为每毫升 0.064 微克。
现在，收集包含绅士的E条的第二个板，并确定MIC值组合，如前面演示。要评估组合的效果，首先计算青霉素G的分馏抑制浓度或FIC，将MIC结合为抗生素的MIC。重复此过程的绅士。然后，使用此处所示的方程计算 FIC 指数。组合的 MIC 值减少两倍，可产生小于或等于 0.5 的 FIC 指数值，并表现出青霉素 G 和 gentamicin 之间的协同作用。在这种情况下，计算的 FIC 值为 1.18，大于 0.5。因此，结果不能证明青霉素G和根霉素对链球菌组G菌株的协同作用。
要确定交叉测试的结果，首先确定生长抑制区与其各自的 E 条相交的点。读取对应于此交点的每个电子测试条上的数值。这些值表示青霉素 G 和根霉素的组合的 MIC 值。接下来，要评估组合的效果，请使用此处所示的方程计算 FIC 指数。在此示例中，计算的 FIC 值为 1.18，大于 0.5。这意味着青霉素G和根霉素对链球菌组G菌株不协同作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
电子测试中的 MIC 值
图1中将单个MIC值确定为青霉素G的0.094微克/mL和8微克/mL对根霉素。对于协同测试，两者都证明了青霉素G的MIC值为0.064微克/升（图2，3），而文母素具有用于交叉和非交叉测试的MIC 4 μg/mL。请注意，由于两个设置中的条带的孵育时间不同，交叉测试和非交叉测试之间可能会出现细微差异。
协同效应的计算
FIC 的等式是：
• 1.18 >0.5 （无协同）
肉汤中的 MIC 测定
水井的云层表明细菌生长，因此没有发生抑制。含青霉素G的第一口井（图4）含有0.12微克/mL青霉素G，因此这是MIC值。对于根特霉质，第一口清井在8μg/mLgentamicin存在。青霉素 G 值略高于使用 E 测试时，原因是条带的分辨率较高（例如，基于 1.5 倍因数序列稀释，而不是 2 倍因子）。
接种大小
为了确定接种大小，使用了图 5和图 6中概述的方法。殖民地被计算在D行（1000x稀释），加起来为7，8和8在三联系列与平均值7.67 cfu。与稀释系数（例如 1000x）相乘的菌落数量，以及 100 倍获得 cfu/mL 的菌落数量，使接种量约为 8 x 105，在目标接种量为 105-6 cfu/mL 的范围内。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
抗生素耐药性是一个世界性的健康问题。为了确定微生物的抗药性机制，用不同抗生素进行协同和对抗的方法测试至关重要。电子测试方法快速、易于复制，可用于研究联合疗法的任何协同潜力。也可以评估肉汤稀释法以预测杀菌活性。为了研究不同微生物的抗药性机制，了解协同和对抗性抗生素相互作用至关重要。结合抗生素可能是提高治疗效果和面临抗生素耐药性的策略。在这里进行的测试中，我们能够确定G组青霉素G和金霉素的MIC值。我们还证明，这两种抗生素并不表现出协同效应，因此不是这种感染的首选治疗方案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Tan SY, Tatsumura Y. Alexander Fleming (1881-1955): Discoverer of penicillin. Singapore Medical Journal. 56 (7):366-7. (2015)
- Aminov RI. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the future. Frontiers in Microbiology. 1:134. (2010)
- Pankey GA, Ashcraft DS, Dornelles A. Comparison of 3 E-test (®) methods and time-kill assay for determination of antimicrobial synergy against carbapenemase-producing Klebsiella species. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 77 (3):220-6. (2013)
- EUCAST: European Committee On Antimicrobial Susceptibility Testing (www.eucast.org).
- Wiegand I, Hilpert K, Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2):163-75. (2008)
- Doern CD, When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12):4124-28. (2014)
- Worthington RJ, Melander C. Combination approaches to combat multi-drug resistant bacteria. Trends in Biotechnology. 31 (3):177-84. (2013)
